實驗四、植物體內(nèi)過氧化氫酶對環(huán)境中重金屬污染的響應一、實驗目的（一）掌握分光光度法測定過氧化氫酶的方法；（二）重金屬對過氧化氫酶的影響及其機理。酶：由活細胞產(chǎn)生的具催化功能的蛋白質(zhì)；酶催化底物發(fā)生的生物化學反應（酶促反應）；

2H2O22H2O+O2

過氧化氫酶(catalase)

干旱、重金屬等環(huán)境脅迫下植物機體內(nèi)容易產(chǎn)生ROS（ReactiveOxygenSpecies）如：O2-、H2O2、OH-等，因此激發(fā)保護酶體系（過氧化物酶POD、超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶（CAT）清除自由基，提高抗逆性。幾乎所有的生物機體都存在過氧化氫酶，其普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、動物的肝和紅細胞及某些組織內(nèi)的過氧化體中，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機理。主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不致于與O2在鐵螯合物作用下反應生成非常有害的OH-。二、實驗原理Cu2+使植物體內(nèi)活性氧代謝加強，H2O2積累，使細胞受害，而過氧化氫酶可以清除H2O2，是植物體內(nèi)重要的酶防御系統(tǒng)之一。植物體內(nèi)H2O2含量，過氧化氫酶活性與植物抗逆性密切相關(guān)。H2O2在240nm具有強烈吸收峰。四、實驗方法和內(nèi)容前處理浸種催芽培養(yǎng)（木村B培養(yǎng)液，20℃培養(yǎng)至2葉1心）處理（對照和2.0mMCuSO4處理）1.酶液的提取稱取新鮮水稻葉片0.5g置于研缽中，加入2-3ml4℃預冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中。用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，并合并沖洗液，定容。容量瓶于4℃冰箱中靜置10min，取上清液在4000rpm下離心10min，上清即為粗酶液。2.測定取10ml試管3支，其中2支為樣品管，1支為空白管，按表1加入試劑。表1紫外分光光度法測定H2O2樣品配置表mlS0S1S2粗酶液0.20.20.2磷酸緩沖液1.51.51.5蒸餾水1.01.01.0H2O20.30.30.3對照管：煮沸3-5min;樣品管25℃預熱5min樣品管25℃預熱后，逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4次。對照管在煮沸5min后加入H2O2，并測定。等3支試管測定完后按下式計算酶活性。3.結(jié)果計算式中AS0－加入煮沸酶液的對照管吸光值；AS1，AS2－樣品管吸光值；VT－粗酶提取液總體積（25ml）；V1－測定用粗酶液體積（0.2ml）；FW－樣品鮮重；0.1－A240每下降0.1為1個酶活力單位；t－從加過氧化氫到最后一次讀數(shù)的時間（3min）