細(xì)胞死亡判定提綱細(xì)胞死亡判定意義細(xì)胞死亡定義及判定方法細(xì)胞死亡判定方法中存在的問(wèn)題細(xì)胞死亡判定方法使用—兼談人體死亡判定一細(xì)胞死亡判定意義發(fā)酵抗癌藥物篩選二細(xì)胞死亡定義及判定方法平板計(jì)數(shù)法1.繁殖力克隆形成實(shí)驗(yàn)clonogenicassayMPNmostprobablenumber2.1細(xì)胞膜完整性顯微鏡觀察？電子顯微鏡？染料類別膜通透性染料非膜通透性染料常見(jiàn)膜完整性檢測(cè)用染料傳統(tǒng)可見(jiàn)染料：甲基藍(lán)、Evan’sBlue、NeutralRed傳統(tǒng)可見(jiàn)染料的不足熒光染料：PI、SYTOX、SYBREB&FDA流式細(xì)胞儀的優(yōu)點(diǎn)準(zhǔn)確快速：一般分選速度＞1000個(gè)/秒

大量多參數(shù)同時(shí)分析（形狀，尺寸大小，熒光顏色及強(qiáng)度）Lymphocytes:淋巴細(xì)胞Monocytes：?jiǎn)魏思?xì)胞Granulocytes：粒細(xì)胞PI&AnnexinV-FITC分析細(xì)胞凋亡問(wèn)：凋亡細(xì)胞是活細(xì)胞還是死細(xì)胞？2.2細(xì)胞膜電位ATP測(cè)定方法ATPADP熒光素加氧熒光素?zé)晒馑孛富罴?xì)胞比率處理組含量對(duì)照組含量=100%ATP法特點(diǎn)敏感性高：可檢測(cè)最少20個(gè)細(xì)胞適用范圍較廣：可對(duì)實(shí)體瘤、胸腹水、血液等多種腫瘤標(biāo)本進(jìn)行體外藥敏檢測(cè)時(shí)間短：30-60分鐘內(nèi)Tetrazolium家族四氮唑化合物3.2氧化還原脫氫酶MTS還原產(chǎn)物具溶解性3.3

pH梯度檢測(cè)染料carboxyfluorescein(cF),BCECF,pyraninecSNARF-1pHandHealth熒光素二乙酯（FluoresceinDiacetate，F(xiàn)DA）4.酯酶5.分子生物學(xué)技術(shù)DNA等分子在死亡細(xì)胞中比活細(xì)胞中更快降解長(zhǎng)序列監(jiān)測(cè)技術(shù)比短序列監(jiān)測(cè)更能反映生命力檢測(cè)對(duì)象DNArRNAmRNA檢測(cè)方法：DNAprobe檢測(cè)方法：PCRPCR擴(kuò)增方法RT-PCRNASBA(nucleicacidsequence-basedamplification,依賴性核酸序列的擴(kuò)增)RT-SDA(reversetranscriptase-stranddisplacementAmplification,鏈替代擴(kuò)增)細(xì)胞死亡判定方法總結(jié)Keer&Birch,2003三細(xì)胞死亡判定方法中存在的問(wèn)題現(xiàn)有方法存在的相關(guān)問(wèn)題1膜完整性測(cè)試：染上顏色的細(xì)胞一定是死亡細(xì)胞？MTT,FDA：沒(méi)有染上顏色的細(xì)胞一定是死細(xì)胞？膜完整性測(cè)試活性染料陰性細(xì)胞能否再存活？Caronetal.,1998問(wèn)題2：活性染料越深生命力越強(qiáng)？Resveratrol白藜蘆醇蒽醌萜類化合物蓼科植物虎杖白藜蘆醇的功效天然的抗氧化劑葡萄酒中的抗癌明星法蘭西奇跡具有神奇抗癌效能的白藜蘆醇白藜蘆醇的抗白血病作用白藜蘆醇處理細(xì)胞MTT還原活性白藜蘆醇處理細(xì)胞MTT還原活性生長(zhǎng)抑制細(xì)胞MTT還原活性上升原因探討B(tài)reeuweretal.,1994.AEM.60(5)1467-1472Jochem,1999.MarineBiology.135:721-728酯酶活性的存在

2.完整的細(xì)胞膜問(wèn)題3：FDA染色中存在的問(wèn)題0C0C30C■DES▲DCCD●noneEnergy-dependent,Carrier-Mediatedextrusion▲TPP●none緩沖液等對(duì)熒光強(qiáng)度的影響培養(yǎng)基組成對(duì)熒光強(qiáng)度的影響熒光影響因子四細(xì)胞死亡判定方法使用—兼談人體死亡判定以后的科研工作中該如何使用？心肺死亡概念腦死亡判定全腦死亡：循環(huán)和呼吸功能的不可逆終止，或包括腦干在內(nèi)的全腦功能不可逆終止腦干死亡：為意識(shí)和認(rèn)知功能的喪失是腦干上行網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，必將導(dǎo)致患者全腦功能的喪失而死亡。高級(jí)腦死亡：把意識(shí)功能的喪失作為診斷的關(guān)鍵腦死亡男子器官即將移植時(shí)蘇醒Fourmonthsafterhewasdeclaredbraindeadanddoctorswereabouttoremovehisorgansfortransplant,ZachDunlapis