PAGEPAGE2細胞生物學實驗教案編寫老師張相鋒生物科學實驗教學示范中心目錄細胞生物學實驗指導 3實驗一、顯微鏡的技術參數(shù)及特殊光鏡的演示實驗 4實驗二測微尺的使用及細胞大小的測量 9實驗三：血涂片制備及瑞氏染色顯示白細胞 11實驗四血細胞的計數(shù) 13實驗四血細胞的計數(shù) 14實驗五線粒體的超活染色與觀察 17實驗六、Brachet染色法顯示RNA 18實驗六、Brachet染色法顯示RNA 19實驗七、PAS法顯示多糖 21實驗八、染色體玻片標本的制作 24實驗九、植物細胞骨架的光鏡觀察 27實驗十、活細胞觀察與死、活細胞鑒別 30實驗十一、動物細胞微絲束的光鏡觀察 31實驗十二、細胞凝集反應 33細胞生物學實驗指導一、實驗課名稱：細胞生物學實驗ExperimentofCellBiology二、實驗課性質：獨立設課三、適用專業(yè)：生物科學四、采用教材及參考書：參考書：1.楊漢民主編．細胞生物學實驗（第二版）．北京：高等教育出版社，1997.72.徐承水，黨本元主編．現(xiàn)代細胞生物學技術．青島：青島海洋大學出版社，19953.王金發(fā)主編．細胞生物學實驗教程．北京：科學出版社，2003五、學時學分：課程總學時：36；課程總學分：1六、實驗項目名稱和學時分配序號實驗項目名稱學時分配實驗屬性實驗類型實驗者類別每組人數(shù)必開/選開1顯微鏡的技術參數(shù)及特殊光鏡的演示3專業(yè)類演示本科/?？?0必開2測微尺的使用及細胞大小的測量3專業(yè)類驗證本科/?？?0必開3血涂片制備及瑞氏染色顯示白細胞3專業(yè)類驗證本科/專科20必開4血細胞的計數(shù)3專業(yè)類驗證本科/?？?0必開5線粒體的超活染色與觀察3基礎類驗證本科/專科20必開6Brachet染色法顯示RNA3基礎類驗證本科/?？?0必開7PAS法顯示多糖4專業(yè)類驗證本科/?？?0必開8染色體玻片標本的制作6專業(yè)類綜合本科/?？?0必開9植物細胞骨架的光鏡觀察5專業(yè)類綜合本科/?？?0選開10活細胞觀察與死、活細胞鑒別3基礎類驗證本科/?？?0選開11動物細胞微絲束的光鏡觀察5專業(yè)類綜合本科/專科20選開12細胞凝集反應3專業(yè)類驗證本科/?？?0選開實驗一、顯微鏡的技術參數(shù)及特殊光鏡的演示實驗一、實驗要求了解普通光鏡及各種特殊光鏡的構造、成像原理及應用；掌握正確的使用方法；理解顯微鏡的技術參數(shù)和特殊光鏡的結構特點；掌握實驗報告的寫法。二、實驗內容普通光學顯微鏡的結構及技術參數(shù)：由光學和機械兩大系統(tǒng)構成。1、光學系統(tǒng)及成像原理：（1）光學系統(tǒng)的構成：物鏡、目鏡、聚光器、光源部件等（2）成像原理：根據(jù)透鏡成像的原理，對微小物體進行放大（二次成像）。當被檢物體放在物鏡前方的1－2倍焦距之間，光線通過物鏡在鏡筒中形成一個倒立的放大實像，這個實像恰好位于目鏡的焦平面之內，通過目鏡后形成一個放大的倒立虛像。通過調焦裝置使A2B2落在人眼睛的明視距離（25mm）處，使眼睛看到的物體最清晰。2、機械系統(tǒng)：（從下往上）（1）鏡座－位于最底部，是整臺顯微鏡的基座，用于支持和穩(wěn)定鏡體。有的在鏡座內裝有照明光源；（2）載物臺－也稱鏡臺，位于物鏡轉換器下方的方形平臺，用于放置被觀察的玻片標本。中央有圓形的通光孔，來自下方的光線經(jīng)此折射到標本上。（3）鏡臂－支持鏡筒和鏡臺的彎曲狀結構，是取用顯微鏡時握持的部位。（4）調焦螺旋－調節(jié)焦距的裝置，可使載物臺升降，調好焦距，使物像呈現(xiàn)在視野中。（5）物鏡轉換器－裝載不同放大倍數(shù)的物鏡。轉動旋轉盤可使不同物鏡達到工作位置（與光路合軸），使用時注意憑手感使所需物鏡準確到位。（6）鏡筒－上端裝有目鏡，下端與物鏡轉換器相連物鏡轉換器。3、顯微鏡的技術參數(shù)：（1）分辨率（resolution）：指在25CM的明視距離處能區(qū)分開被檢物體上兩個相近質點的最小距離（顯微鏡能將鄰近的兩個質點分辨清楚的能力）。R=0.61λ/N.A=0.61λ/n·sin(α/2)λ-照明光線波長；N.A－物鏡的數(shù)值孔徑；n為介質的折射率；α為鏡口角。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？通常2θ最大值可達140°，θ角最大為70，Sin70°=0.94；λ一般0.45μm（藍色光），由公式可知當λ和Sin值均不變時，介質折射率n越大，能區(qū)分的二點之間的距離就越短，物鏡的分辯率越好。n=1（空氣中），分辨率R=0.29um；n=1.52（油鏡下）R＝0.19um，油鏡下分辨率更好。R=0.2um光鏡的分辨極限（2）放大率：放大倍數(shù)。M=Mob×Moc=△/f1×250/f2Mob－物鏡放大倍數(shù)；Moc－目鏡放大倍數(shù)；△－光學筒長（單位：mm）；f1－物鏡焦距（mm）；250－明視距離（mm）；f2－目鏡焦距(mm).物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而言的，鏡筒長度的變化不僅導致放大率的變化，而且成像質量也受到影響。因此，顯微鏡的鏡筒長度是一定的。適宜的總放大率是所用物鏡數(shù)值孔徑的500－1000倍，在此范圍內稱為有效放大倍數(shù)。（3）清晰度：顯微鏡形成輪廓明顯物像的能力。影響物像清晰度的主要因素是物鏡。同一光學系統(tǒng)中，放大倍數(shù)越高，像差就越大。要提高物像的清晰度，必須使用高數(shù)值孔徑的物鏡，并匹配低倍的目鏡，而不應單純增加目鏡的放大倍數(shù)。（蓋玻片的厚薄都會導致光學筒長的變化，國際同一標準蓋玻片厚度為0.17mm）（4）焦點深度：當顯微鏡對標本的某一點或平面聚焦時，焦點平面上下物像清晰的距離或深度。T=K·n/M·NAM-顯微鏡的總放大倍數(shù)；K-常數(shù)，約等于0.24；n=被檢測物體周圍介質的折射率；NA=物鏡的數(shù)值孔徑4、顯微鏡的使用：（以普通光學顯微鏡為例，嚴格按照正確的操作規(guī)程進行）三、注意事項1、使用前一定要檢查上一組的同學是否規(guī)范的放置好顯微鏡：斷電源、開關處于關的狀態(tài)、視場光闌最小、載物臺位置是否處于最低的狀態(tài)、任何物鏡都不與光路合軸。如果放置規(guī)范，可以進行后續(xù)的操作，否則，請按照上述要求調整顯微鏡的狀態(tài)；2、光路合軸－將照明光束與顯微鏡的光軸調整到同一軸線上，使光源均勻的照明視場。具體操作：轉動聚光器的升降旋鈕，把聚光器升至最高位置。打開電源燈開關，將標本放置在載物臺上，用低倍鏡聚焦?？s小視場光闌，在視場中可見邊緣模糊的視場光闌圖像，稍微降低聚光器，到視場光闌的圖像清晰為止。旋轉聚光器上的兩個調中螺桿，將視場光闌圖像調至視場中心；打開視場光闌，使圖像周邊與視場邊緣相接。反復縮放視場光闌，確認光闌與視場完全重合即可。（一般學生用鏡是事先調好的，所以此步略）3、光闌的調節(jié)孔徑光闌－把孔徑光闌縮小到所用物鏡數(shù)值孔徑的70％－80％為宜。視場光闌－適宜大小應以光闌的內緣線外切孔徑光闌或孔徑光闌外邊內接視場光闌為度。4、油鏡的使用：用香柏油或石蠟油作為介質。減少光線的折射，增加視野亮度，提高分辨能力。四、正確的操作規(guī)程1、將標本在載物臺上固定好；2、插上電源，打開電源燈；3、旋轉物鏡轉換器，將低倍物鏡與光路合軸；4、慢慢調大視場光闌，眼睛從側面注視載物臺，轉動粗準焦螺旋，將載物臺升至最高；然后眼睛注視目鏡，慢調粗準焦螺旋是載物臺慢慢下降，直至在目鏡中能看到標本模糊的圖像；再選擇用細調，調至清晰；5、使用物鏡轉換器調至高倍鏡，調節(jié)細準焦螺旋至標本圖像最清晰；6、進一步調整視場光闌，使視野中光線亮度及圖像亮度達到最適為止；7、觀察完后，轉動粗調螺旋使載物臺下降，后小心取下玻片標本（防止用力過猛將玻片摔碎，防止玻片擦壞物鏡和目鏡），擦凈載物臺；8、旋轉物鏡轉換器，不讓任何物鏡與光路合軸（防止物鏡不慎跌落砸壞載物臺及通光孔）；將視場光闌調至最??；9、關掉電源燈；10、小心拔下電源插頭；11、擺正顯微鏡，將其放到桌上安全的地方，套上防護罩。（三）幾種特殊類型的光學顯微鏡：暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡發(fā)展方向：使用波長較短的光作為光源，不斷提高顯微鏡的分辨率。1、暗視野顯微鏡－照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，視野背景是黑的，物體邊緣是亮的。原理：暗場顯微鏡與普通鏡的區(qū)別，在于裝配了一套特殊的聚光器——暗視場聚光器。暗場聚光器的中央有一較大的園形光檔，外周是一圈透光光闌，當光射入時，由于光檔作用，擋住了進入視野中的直射光，所以看到的視野一片黑暗，但光檔外圈光闌可射入環(huán)狀光束，這些光束經(jīng)聚光鏡拋物面反射匯聚于樣品處，并斜向照明樣品，使被照明的樣品發(fā)出反射光和散射光進入物鏡，使看到的物體明亮，而背景是暗的。該法雖看不清微粒的結構，但可分辯出0.004μm小微粒的存在和運動。主要用途：觀察活細胞的幾何輪廓及其運動，如鞭毛、染色體、紡錘體，但不能辨清其微細結構。放射自顯影得到的銀顆粒進行定量計數(shù)。提高物象與背景間的反差，提高分辨率40多倍，可觀察4-200nm的微粒。2、熒光顯微鏡－高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)，發(fā)出一定波長的光作為激發(fā)光，能激發(fā)標本的熒光物質發(fā)出一定的熒光，再通過物鏡和目鏡放大后觀察。原理：利用被長較短的藍紫光或紫補光照射樣本，使樣本中分子、原子的外層電子從低能態(tài)軌道躍遷，即從較低能整進入較高能態(tài)，在這種高能態(tài)不穩(wěn)定，在很短時間后，電子就要返回原來的穩(wěn)態(tài)軌道，這種回歸釋放出的能量就是熒光。放出的熒光波長較原來激發(fā)光的波長要長，熒光比較柔和。熒光有二種：一種是自發(fā)熒光，它是胞內某些天然物質經(jīng)紫外光照射后發(fā)出的光，如植物葉綠體中的葉綠素，就能發(fā)出血紅色的熒光。另一種是誘發(fā)熒光。誘發(fā)熒光是將熒光染料物質（熒光色素，如酸性品紅、甲基綠、中性紅、丫啶橙、丫啶黃，剛果紅等）加入細胞中，經(jīng)過染色后產(chǎn)生的熒光。標本經(jīng)固定后，用丫啶橙染色，可使細胞內的RNA發(fā)出紅色熒光，使DNA發(fā)出綠色熒光。熒光染色劑的濃度很低，不毒害細胞，可進行活體觀察。光鏡水平對特異蛋白質等生物大分子定性、定位的有力工具。用途：切片或活體染色的細胞免疫熒光觀察，研究組織、細胞中物質的吸收、運輸及化學物質的分布、定位，基因定位，疾病診斷。3、相差顯微鏡－1935年，荷蘭籍德國人F.Zermike成功設計了相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope)，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。原理：利用光干涉、衍射現(xiàn)象把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的明暗對比度，使各種結構變得清晰可見，使肉眼得以觀察到無色透明物體中的細節(jié)。構造：相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。（1）環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：轉盤聚光器上有一系列的透光的、大小不一的明亮圓環(huán)，調節(jié)進光量，光線通過其通光孔進入放大倍數(shù)與物鏡匹配。（2）相位板（annularphaseplate）：物鏡中的后焦面加了相位板，其上為一暗環(huán)。相板上涂有氟化鎂，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ，從而造成振幅疊加或抵消，引起正反差或負反差。4、倒置顯微鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞或細菌（四）特殊光鏡的正確操作（略）。五、思考題怎樣提高顯微鏡的分辨率？簡述普通光學顯微鏡的操作注意事項。列表說明暗視野顯微鏡、相差顯微鏡及熒光顯微鏡的工作原理及其應用。

實驗二測微尺的使用及細胞大小的測量一、實驗內容安裝并用鏡臺測微尺標定目鏡測微尺，然后用目鏡測微尺測量裝片細胞的大小。二、實驗要求掌握目鏡測微尺和鏡臺測微尺的使用方法，學會顯微測量細胞的大小。三、實驗儀器與材料普通光學顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、魚血細胞裝片、馬蛔蟲子宮細胞裝片。四、實驗內容目鏡測微尺是一塊圓形的玻片，中心刻有一尺，長5－10mm,分成50－100格，每格實際長度因不同物鏡的放大率和不同鏡筒長度而異。鏡臺測微尺是在一塊載玻片中央，用樹膠封固一圓形的測微尺，長1或2mm,分成100或200格，每格的實際長度為0.01mm(10μm)。當用目鏡測微尺來測量細胞的大小時，必須先用鏡臺測微尺換算出目鏡測微尺每一格的長度。方法如下：1、調好顯微鏡，使其處于工作狀態(tài)；2、在顯微鏡載物臺上放置鏡臺測微尺，轉動顯微鏡鏡筒并移動鏡臺測微尺，調整目鏡測微尺的縱線與鏡臺測微尺刻度線平行并重合的位置，將目鏡測微尺的一條細線與鏡臺測微尺的一條細線重合在一起（使兩尺左邊的一直線重合），然后由左向右找出兩尺另一重合的直線并記錄兩條重合線間兩尺的格數(shù)；3、按照下列公式計算目鏡測微尺每格等于多少微米，X=na/MX—目鏡測微尺每格的實際刻度值；a—鏡臺測微尺每格的刻度值（通常為10um）；n－鏡臺測微尺的刻度數(shù)；M－目鏡測微尺的刻度數(shù)。舉例：如果鏡臺測微尺4格＝目鏡測微尺6格，那么目鏡測微尺每格代表的長度為X=na/M=4×10/6＝6.7μm4、細胞大小的測量：將待測細胞裝片放在載物臺上，調清物象后，用目鏡測微尺測量其各徑所占格數(shù)，并根據(jù)標定結果計算徑的實際長度。（注意：測量和標定時物鏡放大倍數(shù)應一致）5、計算：根據(jù)測量結果計算各種細胞及細胞核的體積橢球形：V＝4πab2/3a－長半徑，b－短半徑圓球形：V＝4/3πr3r－半徑圓柱形：V＝πr2hr－半徑，h－高五、實驗作業(yè)分別測量10個馬蛔蟲子宮細胞和10個魚血細胞大小，對其大小差異形成直觀概念。（要求記錄標定數(shù)據(jù)、原始測量數(shù)據(jù)、標定和計算過程）實驗三：血涂片制備及瑞氏染色顯示白細胞一、實驗內容采血并制備血涂片；瑞氏染色法顯示血涂片中的白細胞二、實驗要求掌握正確的采血及涂片制備方法；掌握瑞氏染液成分組成；掌握瑞氏染色原理、過程，熟悉染色結果的分析。三、實驗儀器與材料普通光學顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、魚血細胞裝片、載玻片、采血針、酒精棉球。瑞氏染液：由酸性染料伊紅（E-）和堿性染料亞甲藍（M+）組成。伊紅通常為鈉鹽，有色部分為陰離子。亞甲藍（又名美藍）為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結構。通常為氯鹽，即氯化美藍，有色部分為陽離子。美藍容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料（即天青）。將適量伊紅、美藍溶解在甲醇中，即為瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美藍和伊紅；二是固定細胞形態(tài)。瑞氏粉0.1g置潔凈研缽中，加入10~20ml甲醇，充分研磨，將已溶部分移入試劑瓶中，未溶部分加適量甲醇研磨，直至全部溶解。24h后即可使用，保存時間越久，染色能力越強。四、實驗內容（一）血涂片的制備：1、準備兩張經(jīng)過脫脂的干凈載玻片。2、用70％酒精棉球消毒指腹或耳垂。3、用消毒過的針刺破指腹或耳垂的皮膚，擠去第一滴血不要（因含單核白細胞較多），用載玻片的一端與血滴接觸。取另一張載玻片，斜置血滴左緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀，兩玻片的角度以45°為宜（角度過大血膜較厚，角度小則血膜?。?，輕輕將沾有血液的載玻片向前推進，速度要一致，否則血膜成波浪形，厚薄不勻（初學者可把玻片放在桌上操作）。4、使涂片在空氣中自然干燥備用。制作不理想者需要重新制備。（二）瑞氏染色法顯示白細胞：原理：既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用。各種細胞成分化學性質不同，對各種染料的親和力也不一樣。如血紅蛋白、嗜酸性顆粒為堿性蛋白質，與酸性染料伊紅結合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質；細胞核蛋白、淋巴細胞、嗜堿性粒細胞胞質為酸性，與堿性染料美藍或天青結合，染紫藍色或藍色，稱為嗜堿性物質；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結合，染淡紫紅色，稱為嗜中性物質；完全成熟紅細胞，酸性物質徹底消失后，染成粉紅色。步驟1、待血涂片干燥后加瑞氏染色液5~8滴覆蓋整個血膜，1min；2、直接清水沖洗，水流不宜過大，至水中無色即可。不可先倒掉染液，防止染液殘渣留在細胞中影響染色結果。3、紗布擦干或吸水紙吸干玻片下端（無細胞面）的水，然后置于載物臺上進行觀察，先用低倍鏡查找，后用高倍鏡觀察細節(jié)。4、繪圖并進行結果分析：紅細胞不著色，白細胞有核，分為中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞。

實驗四血細胞的計數(shù)一、實驗內容指尖采血并對紅細胞進行計數(shù)。二、實驗要求掌握正確的采血方法；掌握血球計數(shù)板計數(shù)細胞的方法三、實驗儀器與材料普通光學顯微鏡、血球計數(shù)板、血蓋片（2盒）、采血針（每人1只）、75％酒精、消毒棉球、100×10毫米玻璃試管（25只）、試管架（4個）、吸管（25支）、血球計數(shù)板（25塊）、擦鏡紙。試劑：生理鹽水（0.9％NaCl液）：稱取4.5克氯化鈉，溶于500毫升蒸餾水四、實驗內容（一）細胞計數(shù)板的結構：血細胞計數(shù)板為一塊特制的長方形厚載玻片，在中部1／3面積處有4條槽。內側2條槽之間還有1條橫槽相通，因此在中部構成2塊長方形平臺。此平臺比整個載玻片的平面低0.1mm。平臺中部各刻有1個含9個大方格的方格網(wǎng)，為計數(shù)室。每1個大方格邊長1mm，面積為1mm2，體積為0.1mm3。四角的每1個大方格又被分為16個中方格，適用于白細胞、血小板和培養(yǎng)細胞的計數(shù)。中央的大方格則由雙線劃分為25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，適用于紅細胞、微生物細胞的計數(shù)。細胞計數(shù)時，先按照一定比例將細胞稀釋，取適量稀釋液加入計數(shù)板的計數(shù)室，然后準確計數(shù)，最后換算出單位體積的細胞數(shù)。計算公式如下：白細胞：白細胞個數(shù)/mm3=四角的4個大方格（共4×16中格）內細胞數(shù)/4×10×稀釋倍數(shù)紅細胞：紅細胞數(shù)/mm3=中央大方格中的四角和中央的中方格（共5個中方格）內紅細胞總數(shù)/5×25×10×稀釋倍數(shù)（二）實驗步驟1、準備細胞稀釋液：準確量取5ml生理鹽水加入試管中。2、制備血細胞稀釋液：（1）用消毒干棉球醮75％酒精消毒左手無名指或耳垂邊緣，待酒精揮發(fā)后用采血針刺入皮膚約2～3mm深，讓血液自然流出。★采血時必須待皮膚上的消毒酒精揮發(fā)后才能穿刺，否則流出的血液不能成滴，無法吸取。（2）用消毒干棉球拭去第1滴血液，待流出第2滴血成大滴時，用采血管吸血至20mm3刻度處?！镂獣r應注意，不可過度擠壓組織以圖加速血液流出；★吸血時應盡量利用毛細管現(xiàn)象使血液自動進入吸管內?！锊僮饕?，以防止血液凝固?！锶粞鲆?guī)定刻度1～2mm，可用干棉球輕觸管口（此時須執(zhí)管于水平位置），吸去多余部分，使血液面恰至規(guī)定刻度處。拭去附著于吸管尖端外部的血液?！锶粞好娉^規(guī)定刻度2mm以上或吸入氣泡，則應重新吸取血液。（3）將吸管內血液放入盛有生理鹽水的小試管底部。3、滴片：將血細胞計數(shù)板擦干凈，先蓋好血蓋片，然后用吸管吸取已稀釋的細胞懸液，滴在血蓋片邊緣，讓細胞液自動流入計數(shù)室內。靜止片刻，待細胞下沉后可計數(shù)?！镉嫈?shù)板和蓋玻片在使用前必須用軟綢或擦鏡紙擦凈，并在低倍鏡下檢查計數(shù)室是否干凈，其刻度是否清晰?！镆话銘淮纬湟菏褂嫈?shù)室內充滿稀釋血液，若經(jīng)幾次充液，易形成氣泡4、計數(shù)：將計數(shù)板放在載物臺上，在低倍鏡下按一定方向逐格數(shù)出細胞數(shù)。★為防止重復計數(shù)和漏數(shù)，計數(shù)時應遵循一定的順序進行，即“從左到右，自上而下”；對正好壓在格線上的血細胞，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則進行計數(shù)。5、計算：算出每立方毫米的細胞數(shù)。白細胞：白細胞個數(shù)/mm3=四角的4個大方格（共4×16中格）內細胞數(shù)/4×10×稀釋倍數(shù)紅細胞：紅細胞數(shù)/mm3=中央大方格中的四角和中央的中方格（共5個中方格）內紅細胞總數(shù)/5×25×10×稀釋倍數(shù)6、清洗血細胞計數(shù)板蓋玻片及計數(shù)板用過之后，必須立即用水沖洗，但不可用硬物刷洗。計數(shù)板晾干或吹風機吹干后，應鏡檢計數(shù)室是否干凈，如不干凈必須重復洗至干凈為止。五、實驗作業(yè)1.簡述細胞計數(shù)時應注意的問題2.簡要寫出自己的計數(shù)流程（測哪種類型細胞，測哪個格中細胞數(shù)，計數(shù)是多少），并分別計算出每組男生、女生血液中每立方毫米的紅細胞數(shù)。

實驗五線粒體的超活染色與觀察一、實驗內容以口腔粘膜上皮細胞為實驗材料，采用詹納斯綠染色法顯示細胞中的線粒體。二、實驗要求掌握口腔上皮細胞臨時標本的制做方法，掌握各操作步驟的作用及注意事項。三、實驗儀器與藥品光學顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、消毒牙簽、吸水紙、擦鏡紙。詹納斯綠B染液、生理鹽水。四、實驗內容原理：線粒體是細胞內一種重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的?；铙w染色是應用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內某些結構而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。詹納斯綠B（JanusgreenB）是線粒體的專一性活體染色劑。線粒體中細胞色素氧化酶系使染料保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，而在周圍的細胞質中染料被還原，成為無色狀態(tài)。步驟：（一）口腔粘膜上皮細胞涂片的制作：1、將載玻片刷洗干凈，用紗布擦干，置于實驗臺的適當位置；2、蒸餾水漱口，將牙簽粗的一端放入自己口腔中；3、用力適當?shù)脑诳谇活a內刮幾下（用力輕重適宜，以獲得活力旺盛的細胞，又不損傷）4、將刮下的白色粘性物薄而均勻地涂在載玻片上（可用生理鹽水，細胞容易展開；可不用，不用的容易貼壁）；（二）染色：5、在載玻片中央滴一滴中性紅—詹納斯綠B（JanusgreenB）染液，均勻涂于染液中，染色0.5～1min，加蓋玻片后立即觀察。6、繪圖并描述現(xiàn)象。低倍鏡下可見成群或分散存在的口腔內粘膜上皮細胞，形態(tài)大多呈扁平狀，核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，被染成淡藍色。選擇單個輪廓清楚的細胞，轉換高倍鏡觀察，可見細胞質中散在一些被染成亮綠色的粒狀和短棒狀的顆粒，即線粒體（如下圖）。

實驗六、Brachet染色法顯示RNA一、實驗內容以洋蔥鱗莖內表皮為實驗材料，采用Brachet染色法顯示細胞中的RNA及DNA。二、實驗要求了解Brachet染色法顯示RNA及DNA的原理；掌握操作過程。三、儀器與藥品材料：洋蔥藥品：甲基綠（2%）-哌洛寧（1%）混合染料（1：9）儀器：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、剪刀等四、實驗內容原理：Brachet染色法又稱為甲基綠-哌洛寧（mehtyl-green-pyronim）染色法當用甲基綠-哌洛寧混合染料染細胞時，DNA被染成綠色而RNA被染成紅色。1899年由Pappenheim首創(chuàng)，1902年Unna對其進行了改良。1940年Brachet研究證明了其原理：DNA分布于細胞核的染色質上，RNA分布于細胞質及細胞核的核仁內。雖然DNA和RNA在結構上具有很多相似之處，但兩者聚合程度不同，DNA聚合程度較高，RNA聚合程度較低。甲基綠和派洛寧都是堿性染料：甲基綠屬于三芳基甲烷，芳環(huán)的對位上有氨基，甲基連在N原子上；派洛寧是氧雜蒽衍生物。PH4.6時，甲基綠與派洛寧跟核酸發(fā)生競爭性結合。甲基綠與DNA雙螺旋外側的磷酸根基團結合力強，結合后阻止派洛寧從堿基之間插入DNA被甲基綠染成綠色。派洛寧與RNA結合力強，RNA結構松散，派洛寧可以插入，從而中和磷酸基團，阻止甲基綠染色RNA被哌洛寧染成紅色。這樣就能使細胞中兩種核酸分別顯示出來。此反應對PH敏感，染料的純度和染料的結合力都影響染色效果。步驟：1、取材：用鑷子撕取一小塊洋蔥內表皮，剪成4~5mm2的小塊，置于載玻片上。2、染色：用吸管吸取1滴甲基綠-哌洛寧混合染料（Unna染料），滴在表皮上，染色30-40mins。3、沖洗：清水沖洗表皮至水無色即可，并用吸水紙吸干。4、觀察：蓋上蓋玻片后鏡檢。5、繪圖并描述結果細胞質和核仁被染成紅色（富含RNA），細胞核被染成綠色（富含DNA）。證明RNA在細胞中的分布：主要集中在細胞質及細胞核內，后者又主要集中在核仁內。在染色質及染色體內也存在微量RNA。實驗七、PAS法顯示多糖一、實驗內容以草履蟲為實驗材料，采用過碘酸-希夫反應顯示細胞質中的多糖成分。二、實驗要求了解PAS反應的原理；了解多糖在細胞中的分布。三、實驗儀器與藥品材料：草履蟲培養(yǎng)液。儀器：離心機2臺、離心管8～12支、顯微鏡、擦鏡紙、量筒、染色缸8～12只、紗布等；藥品：0.5%過碘酸（HIO4）溶液、Schiff試劑、10%偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）水溶液、1N鹽酸、1%甲基綠水溶液，二甲苯、95%酒精、100%酒精。1、過碘酸酒精溶液配法（新鮮配制）過碘酸（HIO4·2H2O）0.4g95％酒精35ml0.2M乙酸鈉（27.2g溶于1000ml蒸餾水）5ml蒸餾水5ml以上溶液配好后保存在0～4℃的冰箱內，瓶加黑紙，此液如顯棕黃色即失效。如用CH3COONa·3H2O，則M＝136.9，0.2M＝27.4。如用CH3COONa，則M＝82.04，0.2M＝16.4。2、Schiff試劑原液配法先將200ml蒸餾水煮沸，由火上取下，加入堿性品紅1g，充分攪拌，有助于溶解。待溶液冷到50℃時，過濾到磨口棕色試劑瓶中。加入1mol/LHCl（比重1.19的濃鹽酸10ml，蒸餾水110ml）溶液20ml，冷卻到25℃時加入1g偏重亞硫酸鉀（K2S2O5）或偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）、充分振蕩后蓋緊瓶塞，在室溫下放置暗處過夜（至少14～24小時，有時需2～3天）。取出時，其顏色應退至淡黃色或近于無色，（溶液如呈淺紅色可加一匙約0.5g中性活性炭吸色，劇烈振蕩1min），過濾后即得無色品紅（濾液應為無色）。無色品紅配成后須塞緊瓶塞，外包黑布或黑紙，儲存在冰箱（4℃下可保存數(shù)月，冷凍可長期保存）或黑暗低溫處。如果配制后的溶液顏色呈紅色，除因操作步驟的差錯外，多由于堿性品紅或偏重亞硫酸鈉質量不好。如果溶液顏色變?yōu)榉奂t色，則失效不能再用。Na2S2O5+HClNaCl+H2SO3+SO2堿性品紅Schiff試劑3、Schiff酒精溶液配法（配后如略帶紅色仍可使用）避光、避熱、避氧氣。Schiff原液11.5ml1N鹽酸0.5ml純酒精23ml4、亞硫酸水溶液（漂洗液）配法10％偏重亞硫酸鈉水溶液（10克偏重亞硫酸鈉或偏重亞硫酸鉀、加100ml蒸餾水）5ml，蒸餾水90ml，1mol/LHCl5ml，搖勻后塞緊瓶塞。新配制的漂白液二氧化硫氣味很濃，至無味時即不能再用。此溶液不能保持太久，最多6～7天，最好在使用前現(xiàn)用現(xiàn)配，否則會因SO2的逸出而失效。5、1N（1mol/L）鹽酸配法：取密度為1.19的濃鹽酸82.5ml，加蒸餾水至1000ml（如果密度為1.16的濃鹽酸則用98.8ml，加蒸餾水至1000ml）。6、1％甲基綠水溶液配法：1克甲基綠，99ml蒸餾水，再加1ml冰醋酸。四、實驗內容原理：過碘酸是一種強氧化劑，可把多糖氧化成高分子醛化物。具體作用機理是打開多糖中葡萄糖單元的2，3位碳原子之間的連接，同時將多糖中的乙二醇基（CHOH－CHOH）氧化為兩個游離醛基（－CHO）。然后，游離醛基可與Schiff試劑反應，形成紅色-紫紅色的化合物，顏色深淺與多糖含量成正比。步驟1、取草履蟲培養(yǎng)液適量，紗布過濾稻草后，離心無稻草的草履蟲培養(yǎng)液1400轉/分×5min，取沉淀1~2滴滴于載玻片上；2、95%酒精固定10min，此過程中要防止酒精完全揮發(fā)干，要不斷補充酒精；3、滴加幾滴0.5%HIO4作用15min；4、滴加Schiff試劑（暗處室溫）作用30~45min；5、亞硫酸水漂洗三次（除去多余的無色品紅），每次2min；6、清水沖洗約1min后擦干玻片鏡檢。7、繪圖并描述結果。細胞內的糖元呈紅色-紫紅色顆粒。顯色深淺與細胞中乙二醇基含量成正比，多時呈深紫紅色。

實驗八、染色體玻片標本的制作一、實驗內容以小鼠股骨骨髓細胞為實驗材料，采用低滲滴片法制備染色體玻片標本，利用顯微鏡觀察中期分裂相。二、實驗要求掌握動物細胞染色體標本的制做方法，掌握各操作步驟的作用及注意事項。三、實驗儀器與藥品注射器、解剖器具(剪刀、鑷子、解剖刀)、離心管、吸管、試管、水浴鍋、載玻片、離心機、顯微鏡；秋水仙素(0.01％)、乙醇、冰醋酸、生理鹽水，0.075MKCl低滲液、Giemsa染料四、實驗內容（一）背景知識染色體是基因的載體。真核細胞染色體數(shù)目和結構是重要的遺傳指標之一，制備染色體標本無疑是細胞遺傳學最基本的技術。優(yōu)良的染色體制片是進行染色體顯帶、組型分析、原位雜交等的先決條件。染色體的制備在原則上可以從所有發(fā)生有絲分裂的組織和細胞懸浮液中得到。最常用的途徑是從骨髓細胞、血淋巴細胞和組織培養(yǎng)的細胞中制備染色體。在正常動物體內，精巢和骨髓均為活躍分裂的組織，可不經(jīng)PHA處理和體外培養(yǎng)而直接用來制作染色體標本。通過骨髓制備染色體程序比較簡單，一般也無需無菌操作。小型動物的染色體制片最好最有效的材料就是骨髓組織。多采用剝離術取股骨以獲得骨髓細胞。選用小鼠、青蛙或蟾蜍的骨髓細胞作為實驗材料時，操作包括以下幾個要點：取材以前將一定劑量的秋水仙素進行腹腔注射，處理一段時間以破壞紡錘絲的形成，使細胞分裂停滯在中期；骨髓細胞取出后，用低滲液處理使細胞膨脹，以至于在滴片時細胞可破裂，使細胞內的染色體分散平鋪到載玻片上；空氣干燥法滴片可使染色體在載玻片上展平并固定，經(jīng)Giemsa染料染色后便可觀察到染色體的數(shù)量和形態(tài)。（二）實驗步驟：總流程：預處理→取骨髓細胞→低滲+預固定→離心→固定→離心→細胞懸液定容→滴片→干燥→染色→觀察具體步驟：1、前處理：取骨髓細胞前5－8小時向小鼠腹腔內注射秋水仙素（5μg/g)。（將有絲分裂阻斷在中期，增加中期分裂相的比例）2、取材：處死小鼠剖出股骨（注意不要將股骨剪斷，否則容易造成骨髓細胞的流失），將股骨上的肌肉擰擦干凈后，取骨髓細胞。先剪去股骨兩端，再用注射器和針頭吸取生理鹽水溶液，將針頭插入骨髓腔，以生理鹽水將骨髓細胞沖入離心管中(獲得有絲分裂細胞，注意沖出骨髓細胞的動作要快，沖擊量大，細胞多，并要求預溫藥液至25℃)。生理鹽水用量大約6ml。3、染色體制備：（1）低滲：800-1000rpm離心8mins，去除上清液，加入6ml預溫至25℃的0.075M的KCl溶液，用吸管輕輕吹散細胞，置25℃條件下低滲20分鐘。（使細胞膨脹，利于滴片時染色體分散）（2）預固定：800-1000rpm離心8mins，去除上清，加入6ml新制的Carnoy’s固定液（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管輕輕將細胞吹散，固定10mins。（3）固定：離心，去上清，加入6ml新制的Carnoy’s固定液（甲醇：冰乙酸=3：1），混勻，固定10mins,(此步重復兩次)。離心，去上清后，加入約0.5ml新Carnoy’s固定液，用滴管輕輕將細胞吹散，制成細胞懸液。4、滴片取出預冷的干凈載玻片→以60-75cm的高度滴片→自然干燥→Giemsa染料染色10mins→流水沖洗1～2mins→鏡檢5、繪圖并描述結果。五、實驗作業(yè)總結影響制片效果的因素。為什么滴片需要用冰凍的冷載玻片？小白鼠染色體的數(shù)目是多少？請繪制一個中期分裂相。

實驗九、植物細胞骨架的光鏡觀察一、實驗內容以洋蔥內表皮為實驗材料，用光鏡觀察細胞骨架的形態(tài)與分布。二、實驗要求了解細胞骨架的結構，掌握細胞裝片的制片技術。三、儀器藥品與材料水浴鍋、5-10ml塑料離心管、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片、吸管、吸水紙等；6mM磷酸緩沖液PBS、1%tritonX-100（去垢劑）、3%戊二醛、咪唑緩沖液、0.2%考馬斯亮蘭R250染料；洋蔥（1）6mmol/LPBS（pH6.5）A液：NaH2PO4.H2O468mg/500ml;B液：Na2HPO4.12H2O1074mg/500ml；工作液：A液68.5ml+B液31.5ml（用5%NaHCO3調pH至6.5）.（2）M緩沖液（pH7.2）：咪唑3.40g、KCl3.71g、MgCl2.6H2O101.65mg、EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）380.35mg、EDTA（乙二胺四乙酸）29.22mg、甘油292ml，加蒸餾水至1000ml（用1mol/LHCl調pH至7.2）（3）1%TritnoX-100：TritonX-100液1ml、M緩沖液99ml。（4）3%戊二醛：25%戊二醛12ml、6mmol/LPBS液88ml。（5）0.2%考馬斯亮藍R250染液：考馬斯亮藍R250粉末0.2g、甲醛46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml。四、實驗內容原理：細胞骨架是指細胞中縱橫交錯的纖維網(wǎng)絡結構，它們是由各種不同成分的蛋白質組成，按組成成分和形態(tài)結構的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態(tài)的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質運輸?shù)绕鹬匾饔?。當用適當濃度的非離子去垢劑tritonX-100處理細胞時，可以使細胞中的可溶性蛋白和脂類物質被溶解除去。而微絲束是不可溶性蛋白，不會被tritonX-100破壞而留在細胞中，再用固定劑對其進行固定，然后用非特異性蛋白染料（考馬斯亮藍R250)對其進行染色，可在光鏡下觀察細胞骨架的網(wǎng)狀結構。注：考馬斯亮藍R250并不特異的顯示微絲，但由于有些細胞骨架纖維（如，微管）在該實驗條件下不穩(wěn)定，又因某些類型的纖維太細而在光鏡下無法分辨，因此看到的基本是由微絲組成的纖維束，直徑在40nm左右。步驟：1、取材：撕取洋蔥鱗莖內表皮5mm2，浸入裝有6mMPBS緩沖液的燒杯或小瓶內，使材料下沉，處理5mins；2、抽提：吸去PBS，加去垢劑1%TritonX-100液2ml，使液體充分浸泡材料，并立即放入37℃水浴鍋中處理20mins；3、沖洗：吸去1%Triton，用M緩沖液(咪唑+螯合劑+K++Mg2+）輕輕沖洗3次，每次3mins；注：咪唑為緩沖劑，其中的EGTA和EDTA是螯合劑，螯合Ca2+，低Ca2+條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)。在Mg2+和高濃度Na+、K+條件下，球形肌動蛋白裝配成微絲。）4、固定：加3%戊二醛固定15mins；5、沖洗：吸去3%戊二醛固定液，用6mMPBS緩沖液沖洗3次，每次3mins；6、染色：吸去PBS緩沖液，滴幾滴0.2%考馬斯亮蘭R250染料，染色10mins；7、制片：吸去染料，用蒸餾水洗2-3次，將標本平鋪在載玻片上，加蓋片；8、鏡檢：繪制洋蔥表皮細胞骨架圖并描述現(xiàn)象。將制好的片子置于光鏡的低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細胞輪廓，細胞內可見到被染成藍色的粗細不等的纖