超臨界流體色譜法超臨界流體色譜(supercricalfluidchromatography,SFC)是以超臨界流體作為流動(dòng)相的色譜方法，是20世紀(jì)80年代以來發(fā)展迅速的一個(gè)色譜分支，所謂超臨界流體，是指在高于臨界壓力和臨界溫度時(shí)的一種物質(zhì)狀態(tài)。它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低粘度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴(kuò)散系數(shù)等特性。從理論上說SGC既可以分析GC法難以處理的高沸點(diǎn)、不揮發(fā)性樣品，又有比HPLC法更高的柱效和更短的分離時(shí)間，且可使用二者常用的檢測(cè)器，也可與MS、FT-IR光譜儀等在線聯(lián)接，因而可以方便地進(jìn)行定性、定量分析。在中藥藥物分析領(lǐng)域已有愈來愈多的應(yīng)用。一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理

principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1．超臨界流體的特性。對(duì)于某些純物質(zhì)來說，具有三相點(diǎn)和臨界點(diǎn)，如圖所示，從圖中可以看出，物質(zhì)在三相點(diǎn)，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)處于臨界溫度和臨界壓力以上時(shí)，則不論施加多大壓力，氣體也不會(huì)液化，此時(shí)即非氣體，也非液體，而是以超臨界流體形式存在。超臨界流體對(duì)于分離具有極其有用的物理性質(zhì)，這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。表對(duì)氣體、液體、和超臨界流體的有關(guān)物理性質(zhì)進(jìn)行了比較。表氣體、液體、超臨界流體物理性質(zhì)的比較流動(dòng)相密度（g/ml）擴(kuò)散系數(shù)（cm2/s）粘度（g/cm.s）氣體超臨界流體液體約10-30.2-0.90.8-1.01-10-210-3-10-4＜10-510-410-4-10-310-2壓力效應(yīng)：SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對(duì)分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）；超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點(diǎn)，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對(duì)分離的影響?。?/p>

壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對(duì)容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時(shí)間縮短。

CO2流動(dòng)相，當(dāng)壓力改變：7.0→9.0×106Pa，則：C16H34的保留時(shí)間25min→5min。程

序

升

壓HPLC與SFC

比較二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)與流程instrument

structureandthegeneralprocessofSFC1.結(jié)構(gòu)流程

2.主要部件（1）SFC的高壓泵

無(wú)脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測(cè)器，計(jì)算機(jī)控制流動(dòng)相的密度和流量；

（2）SFC的色譜柱和固定相

可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱；SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC；色譜柱①填充柱填充柱與HPLC柱相似，基于分配平衡實(shí)現(xiàn)分離，柱長(zhǎng)可達(dá)25cm，分離柱內(nèi)徑0.5-4.6mm。使用粒徑為3-10μm的填料填充。如硅膠、-NH2、-CN及C18、C8等化學(xué)鍵合相均可用于SFC。其中以極性填料的分離效果更好。SFC在手性化合物的分離上效果優(yōu)于HPLC。在實(shí)際操作中，往往會(huì)因壓力變化而產(chǎn)生較大的柱壓降，使柱入、出口處的保留時(shí)間有很大差異，所以一般采用高于超臨界壓力20%左右的壓力以減小影響。在填料的選擇上也要注意與所分析的樣品相適應(yīng)，如分析極性或堿性化合物時(shí)，填料覆蓋度小，會(huì)產(chǎn)生不對(duì)稱峰。若使用“封端”填料則會(huì)得到改善。主要部件（3）流動(dòng)相SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

CO2應(yīng)用最廣泛；無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒、易得、對(duì)各類有機(jī)物溶解性好，在紫外光區(qū)無(wú)吸收；缺點(diǎn)：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4）檢測(cè)器可采用液相色譜檢測(cè)器，也可采用氣相色譜的FID檢測(cè)器①使用氣相色譜檢測(cè)器，以FID為多用，應(yīng)用時(shí)可將色譜柱的流出物分流，部分流出物通過限流器變?yōu)闅鈶B(tài)進(jìn)入檢測(cè)器，若用FID檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相中不能加入改進(jìn)劑，否則改進(jìn)劑本身將給出信號(hào)干擾測(cè)定，F(xiàn)ID對(duì)小分子量化合物可得到很好的結(jié)果，對(duì)分子量大的化合物常得不到單峰，而是一簇峰。如把檢測(cè)器加熱可使分子量大于2000的化合物獲得滿意的分離。在SFC中也可以使用氮磷檢測(cè)器（NPD）、火焰光度檢測(cè)器（FPD）等。②使用液相色譜檢測(cè)器。在進(jìn)入檢測(cè)器之前應(yīng)將超臨界狀態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)，可增加檢測(cè)的靈敏度，使譜帶變窄，而且可以在室溫下操作，UVD是用改性劑流動(dòng)相的填充柱SFC的最常用的檢測(cè)方法。要求檢測(cè)器必須耐高壓。如使用毛細(xì)管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛細(xì)管構(gòu)成，內(nèi)容積在200nl左右，這樣不會(huì)影響柱效；熒光檢測(cè)器（FD）也可以如此應(yīng)用。對(duì)于填充柱，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器也是一種常用的通用檢測(cè)器。（二）改性劑。在SFC中，弱極性或非極性超臨界流體流動(dòng)相如CO2，對(duì)于一些極性化合物的溶解能力較差。為了加強(qiáng)其對(duì)極性溶質(zhì)的溶解和洗脫能力，常常向其中加入一定比例的極性溶劑稱為改性劑，加入的量一般為1%-5%，以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分適于二氧化碳的改性劑及應(yīng)用特性。

表常用CO2改性劑CO2改性劑檢測(cè)方法CO2改性劑檢測(cè)方法甲醇UVDMSFIDC（用量應(yīng)少于1%）脂肪二甲基亞砜乙二氧甲烷UVUVUVMSUVMS脂肪醇UVMS甲醇UVMSFID四氫呋喃UVMS二氧化碳UVMSFID2-基乙醇UV水UVMSFID在分離酸性或堿性化合物時(shí)，也可以向CO2流動(dòng)相中加入酸或堿，使其峰形變銳。四、應(yīng)用與示例超臨界流體色譜法已被廣泛應(yīng)用于天然物，藥物，表面活性劑，高聚物，農(nóng)藥，炸藥，火箭推進(jìn)劑等物質(zhì)的分離與分析.1.超臨界流體色譜法測(cè)定懷牛膝制劑中齊墩果酸的含量牛膝制劑中含有的齊墩果酸不易揮發(fā)，且含有羥基、羥基等相性基團(tuán)，用GC法測(cè)定須衍生化處理后，才能測(cè)定，又因其結(jié)構(gòu)中無(wú)發(fā)色團(tuán)，本自無(wú)紫外吸收，也不易被激發(fā)產(chǎn)生熒光，若用HJPLC測(cè)定無(wú)法用常規(guī)檢測(cè)器檢測(cè)，而用SFC可直接進(jìn)樣測(cè)定，由于SFC對(duì)GC及HPLC的檢測(cè)器可兼容使用，分辨率也好于HPLC。色譜條件色譜柱：石英毛細(xì)管交聯(lián)柱（10m×50Mm，ID），固定相：SB-Cyanopropyl-50；液膜厚度：0.25Mm；流動(dòng)相：CO2（99.995%）；柱溫：90℃；檢測(cè)點(diǎn)：FID，325℃；壓力程序：15.20MPa，保持7min后以0.81MPa/min升至20.26MPa,再以1.22MPa/min升至35.45MPa,分流進(jìn)樣2Ml，分流比100:15，補(bǔ)充氣：氮?dú)猓埥?0.5cm/min，衰減8。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，取齊墩果酸對(duì)照品適量，加二氯甲烷溶解，并稀釋成濃度為1.921mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液（1.921mg/ml）0.4，0.8，1.2，1.6，2.0及2.6ml，分別置平底燒瓶中，揮去二氯甲烷后，各加2mol/L鹽酸20ml后按樣品分析方法操作，以齊墩果酸與內(nèi)標(biāo)的峰面積比對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸，其回歸方程主：Y=1.7018×10-3+0.3392X、γ=0.9998。樣品測(cè)定精密稱取天麻丸（膠囊內(nèi)藥粉）約1g，每加2mol/L，HCL20ml,超聲振蕩15分鐘，加熱回流水解2小時(shí)，冷卻后濾過，棄去濾液，濾液用蒸餾水洗至中性，烘干，加氯仿20ml振搖后水浴回流1小時(shí)，趁熱濾過，用少量氯仿（2~3ml）沖洗濾紙，回收并揮干氯仿，備用。測(cè)定前精密加入1ml二氯甲烷及1ml甲羥孕酮內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶解后進(jìn)樣測(cè)