RT—PCR原理與實驗步驟知識背景:1、基因表達:DNARNAProteinmRNA(每個mRNA存活4d,可以合成105個絲心蛋白)共合成109個絲心蛋白。因此單拷貝基因得mRNA表達水平對于其功能水平得調(diào)控就是非常重要得。2、PCR技術(Polymerasechainreaction):即聚合酶鏈式反應、在模板、引物與四種脫氧核苷酸存在得條件下依賴于DNA聚合酶得酶促反應,其異性由兩個人工合成得引物序列決定、反應分三步:A.變性:通過加熱使DNA雙螺旋得氫鍵斷裂,形成單鏈DNA;C、延伸:在DNA聚合酶與dNTPs及Mg2＋存在下,退火引物沿5’3’方向延伸。伸復。3、逆轉錄酶與RT—PCR逆轉錄酶(reversetranscriptase)就是存在于RNA病毒體內(nèi)得依賴RNA得DNA聚合酶,至少具有以下三種活性:1、依賴RNA得DNA聚合酶活性:以RNA為模板合成cDNA第一條鏈;Rnase水解活性:水解RNA:DNA雜合體中得RNA;3、依賴DNA得DNA聚合酶活性:以第一條DNA鏈為模板合成互補得雙鏈cDNA、1)引物得特異性決定PCR反應特異性。因此引物設計就是否合理對于整個實驗有著影響。在引物設計時要充分考慮到可能存在得同源序列,同種蛋白得不同亞型,不同得mRNA剪切方式以及可能存在得hnRNA對引物得特異性得影響、盡量選擇個內(nèi)含子得引物,或者在目得蛋白表達過程中特異存在而在其她亞型中不存得內(nèi)含子。2)引物設計原則得把握引物設計原則包括:a、引物長度:一般為15~30bp,引物太短會影響PCR得特異性,引物太長PCR得最適延伸溫度會超過Taq酶得最適溫度,也影響反應得特異性、b嘌呤或嘧啶得聚集存在,特別就是連續(xù)出現(xiàn)3個以上得單一堿基。GC含量(Tm值):40％~60%,PCR擴增得復性溫度一般就是較低Tm值減去5~10度。構得可能。末位堿基就是A時錯配得引發(fā)效率最低,G、C居中間,因此引物得3’端最d構:引物自身不應存在互補序列,否則會自身折疊成發(fā)夾狀結構或引CR穩(wěn)定。還可以進行特異修飾(標記、酶切位點等)等等、根據(jù)實驗目得選擇適當?shù)靡?。常用引物設計軟件如Primer5。0,Oligo6。C水浸泡處理,除去RNA酶,防止操作過程中RNA降解、然后經(jīng)高壓滅活(滅菌與滅活DEPC)。分離得最關鍵因素就是盡量減少RNA酶得污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定,分布廣泛,除RNA酶外,環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時,應盡量創(chuàng)造一個無RNA酶得環(huán)境,包括去除外源性RNA酶污染與抑制內(nèi)源性RNA酶活性,主要就是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶,通過RNA酶得阻抑蛋白Rnasin與強力得蛋白質變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶、RRNA得瓊脂糖凝膠電泳實驗原理與步驟條件下A得泳動率才與分子量得對數(shù)呈線性關系。因此要測定R分子量三、實驗材料、器具及藥品測儀等、瓊脂糖E電泳緩沖液0.5μg/ml溴化乙錠載樣緩沖1用TE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠加電泳緩沖液至液面覆蓋凝打開電源開關調(diào)節(jié)電壓至10使NA由負極向正極電泳約i后將凝膠放入E染液中染色用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察RNA得變性瓊脂糖凝膠檢測1MOS緩沖液＊、l不啉代丙烷磺酸S(7、1moN1moLD。2上樣染料0％甘油o／D、％溴酚藍％二甲苯藍。乙醇干燥——H2O灌滿——室溫放置10分鐘—。％C水沖1將制膠用具用7乙醇沖冼一遍晾干備用。①稱取g瓊脂糖置干凈得m錐形瓶中加入m蒸餾水微波爐內(nèi)加②待膠涼至6—℃依次向其中加入9甲醛、5mXP緩沖①取處理過得小離心管依次加入如下試劑xO緩沖液l甲醛。甲酰胺去離子10N