應(yīng)用生物化學(xué)第1頁(yè)/共44頁(yè)一、離心技術(shù)的應(yīng)用1.用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室分析研究的，轉(zhuǎn)速?gòu)拿糠昼妿浊У綆兹f(wàn)轉(zhuǎn)以上，此類(lèi)技術(shù)的使用目的在于分離和純化樣品，以及對(duì)純化的樣品有關(guān)性能進(jìn)行研究。

2.用于工業(yè)生產(chǎn)的，如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備用的離心技術(shù)，轉(zhuǎn)速都在每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。第2頁(yè)/共44頁(yè)第3頁(yè)/共44頁(yè)第4頁(yè)/共44頁(yè)二、離心機(jī)基本組件1.低速離心機(jī)

轉(zhuǎn)子速度控制系統(tǒng)最高轉(zhuǎn)速在6000rpm以下實(shí)驗(yàn)室中常用于分離制備。2.高速離心機(jī)

系列轉(zhuǎn)子速度控制系統(tǒng)溫控系統(tǒng)最高轉(zhuǎn)速在25,000rpm以下常用于生物大分子的分離制備3.超速離心機(jī)系列轉(zhuǎn)子速度控制系統(tǒng)溫度控制真空系統(tǒng)常用于分離亞細(xì)胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白質(zhì)分子。第5頁(yè)/共44頁(yè)

轉(zhuǎn)子(Rotor)固定角式轉(zhuǎn)子(fixed-anglerotor)水平轉(zhuǎn)子(Swing-bucketrotor)垂直轉(zhuǎn)子(verticalrotor)帶狀轉(zhuǎn)子(zonalrotor)連續(xù)轉(zhuǎn)子(continuousrotor)第6頁(yè)/共44頁(yè)1.固定角式轉(zhuǎn)子離心管在離心機(jī)中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形成一個(gè)固定的角度,角度變化在14-40°之間。第7頁(yè)/共44頁(yè)

固定角式轉(zhuǎn)子第8頁(yè)/共44頁(yè)角式轉(zhuǎn)子的特點(diǎn)：（1）重心低,轉(zhuǎn)速可較高（2）樣品粒子穿過(guò)溶劑層的距離略大于離心管的直徑;

（3）“管壁效應(yīng)”：

有一定的角度,在離心過(guò)程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀,此效應(yīng)使最后在管底聚成的沉淀較緊密。

第9頁(yè)/共44頁(yè)2.水平轉(zhuǎn)子（1）轉(zhuǎn)子靜止時(shí),處在轉(zhuǎn)子中的離心管中心線與旋轉(zhuǎn)軸平行；（2）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時(shí),離心管中心線由平位置逐漸過(guò)渡到垂直位置,即與旋轉(zhuǎn)軸成90°角。第10頁(yè)/共44頁(yè)第11頁(yè)/共44頁(yè)第12頁(yè)/共44頁(yè)水平轉(zhuǎn)子的特點(diǎn)：

（1）轉(zhuǎn)子的重心位置較高（2）樣品粒子沉降穿過(guò)溶劑層的距離大于直徑（3）對(duì)于多種成分樣品分離特別有效（4）常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心第13頁(yè)/共44頁(yè)三、基本原理1.轉(zhuǎn)速

（1）rpm

RevolutionsPerMinute為每分鐘轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)/分）（2）ω角速度：每秒轉(zhuǎn)過(guò)的弧度數(shù)(弧度/秒)

1弧度即為弧長(zhǎng)等于半徑的圓弧所對(duì)的圓心角

ω＝2πrpm60第14頁(yè)/共44頁(yè)2.離心力Centrifugalforce(F)

F離心力=mω2rm:質(zhì)量

ω:旋轉(zhuǎn)角速度

r：旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離第15頁(yè)/共44頁(yè)3.相對(duì)離心力Relativecentrifugalforce(RCF)RCF就是實(shí)際離心力轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)，通常用×g表示

RCF＝F離心力/F重力＝mω2r/m·g=ω2r/g

＝

1.118×10-5×(rpm)2×r半徑第16頁(yè)/共44頁(yè)4.離心轉(zhuǎn)速換算公式（rpm與g）離心速度1000rpm與1000g有什么區(qū)別？（Eppendorf5415C1000g對(duì)應(yīng)3066rpm）（BOECOM-241000g對(duì)應(yīng)3222rpm）

g（RCF）＝1.118×10-5×(rpm)2×r半徑運(yùn)用離心力列線圖換算rpm與g第17頁(yè)/共44頁(yè)離心力列線圖第18頁(yè)/共44頁(yè)5.沉降系數(shù)

Sedimentationcoefficient(S)

樣品顆粒的大小

形狀

密度

溶劑的粘度、密度

離心加速度

S=

X1:離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離

X2:離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離2.1×102logX2/X1rpm2(t2-t1)第19頁(yè)/共44頁(yè)6.沉降速度Sedimentationvelocity定義：指在強(qiáng)大離心作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。V=

ω2rd2(ρp-ρm)18ηd：球形粒子的直徑ρp：粒子的密度ρm：介質(zhì)的密度η：流體介質(zhì)的粘度數(shù)

r：粒子距離心軸垂直半徑第20頁(yè)/共44頁(yè)四、離心分離方法制備型超高速離心機(jī)的幾種分離方法：A．差速離心：

速率區(qū)帶法（ratezonal）B．密度梯度離心法：

等密度離心法（isopycnic）第21頁(yè)/共44頁(yè)A．差速離心：利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別,在同一離心條件下,沉降速度不同,通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力,使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。差速離心的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，但分離純度不高。第22頁(yè)/共44頁(yè)主要細(xì)胞成分的大小細(xì)胞核

4-12m質(zhì)膜

3-20m高爾基體

1-2m線粒體

0.4-2.5m溶酶體/過(guò)氧化物酶

0.4-0.8m微粒小泡

0.05-0.3m第23頁(yè)/共44頁(yè)勻漿組織的差速離心（Ⅰ）1000g/10min去掉上清3000g/10minetc.第24頁(yè)/共44頁(yè)勻漿組織的差速離心（Ⅱ）組織勻漿

–1000gfor10min上清

from1–3000gfor10min上清

from2–15,000gfor15min上期

from3–100,000gfor45min1000g沉淀:細(xì)胞核,質(zhì)膜層3000g沉淀:大線粒體,高爾基管15,000g沉淀:小線粒體,溶酶體,過(guò)氧化物酶100,000g沉淀:微粒

第25頁(yè)/共44頁(yè)差速離心（Ⅲ）固定角轉(zhuǎn)子:短沉淀路徑Fmax>Fmin水平轉(zhuǎn)子:長(zhǎng)沉淀路徑Fmax>>>Fmin第26頁(yè)/共44頁(yè)密度屏障不連續(xù)梯度

連續(xù)梯度B、密度梯度離心第27頁(yè)/共44頁(yè)對(duì)不同粒子怎樣進(jìn)行密度梯度分離?低密度高密度中等密度第28頁(yè)/共44頁(yè)ρp=ρm即

ρp-ρm=0V=0

粒子平衡

ρp>ρm

即ρp-ρm>0V>0

粒子達(dá)到某一位置后就達(dá)到平衡

ρp<ρm即ρp-ρm<0V<0

粒子逆著離心方向上浮V=

ω2rd2(ρp-ρm)18η從方程式預(yù)測(cè)

第29頁(yè)/共44頁(yè)密度梯度離心過(guò)程15234第30頁(yè)/共44頁(yè)1）速率區(qū)帶法（ratezonal）根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速率（S）分離。將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動(dòng)的速度不一樣，所以經(jīng)過(guò)離心后會(huì)形成幾條分開(kāi)的樣品區(qū)帶。注意：樣品粒子的密度（ρp）必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度（ρm

）。離心過(guò)程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。50000rpm×15min50000rpm×20minSTOP第31頁(yè)/共44頁(yè)2）等密度離心法（isopycnic）根據(jù)粒子的不同密度來(lái)分離。離心過(guò)程中，粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。

密度梯度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。注意：平衡后粒子的分離完全由其密度決定，與時(shí)間無(wú)關(guān)。

第32頁(yè)/共44頁(yè)123粒子密度（ρp）<最大介質(zhì)密度（ρm

）

等密度離心法第33頁(yè)/共44頁(yè)不連續(xù)梯度等密度離心法的離心結(jié)果連續(xù)梯度

密度屏障III第34頁(yè)/共44頁(yè)五.

梯度溶液的制備(一).梯度材料的選擇原則:1、與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)。2、可達(dá)到要求的密度范圍,且在所要求的密度范圍內(nèi),粘度低,滲透壓低,離子強(qiáng)度和pH變化較小。3、不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。4、容易純化,價(jià)格便宜或容易回收。5、濃度便于測(cè)定,如具有折光率。第35頁(yè)/共44頁(yè)（二）常用的梯度材料：

糖類(lèi):

蔗糖、甘油、聚蔗糖、右旋糖酐、糖原無(wú)機(jī)鹽類(lèi):CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、NaCl、KBr等有機(jī)碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等硅溶膠:

Percoll。蛋白質(zhì):牛血清白蛋白非水溶性有機(jī)物:氟代碳等第36頁(yè)/共44頁(yè)(三).梯度材料的應(yīng)用范圍

1.蔗糖:

水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，最高密度可達(dá)1.33g/ml,價(jià)格低，容易制備。常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料制備有較大的滲透壓,不宜用于細(xì)胞的分離。第37頁(yè)/共44頁(yè)2.聚蔗糖:

商品名Ficoll,滲透壓低，粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞

第38頁(yè)/共44頁(yè)3.氯化銫:

離子性介質(zhì)，水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g/ml重金屬鹽類(lèi),在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率。被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，價(jià)格較貴。第39頁(yè)/共44頁(yè)4.鹵化鹽類(lèi):

Br和NaCl可用于脂蛋白分離KI和NaI可用于RNA分離,其分辨率高于銫鹽NaCl梯度可用于分離脂蛋白NaI梯度可分離天然或