ELISA法檢測(cè)抗-HBs實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握ELISA的原理和操作方法實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)抗-HBs-Ag，首先用已知抗HBs抗體包被載體，然后加入待測(cè)血清，共同孵育后，抗原結(jié)合于包被抗體上，在加入酶標(biāo)記抗HBs抗體，酶標(biāo)抗體連接到抗原上，最后加入底物溶液，根據(jù)顏色反應(yīng)來判定抗原含量。實(shí)驗(yàn)材料1.豚鼠Anti-HBs。2.待測(cè)血清，陽性，陰性對(duì)照血清。3.HBR標(biāo)記豚鼠Anit-HBs。4.包被緩沖液（0.05mol/LpH9.6碳酸緩沖液）。5.洗滌液（0.01mol/LpH7.4Tris-Cl-Tween20）。6.稀釋液（0.01mol/LpH7.4PBS）。7.顯色液（鄰苯二胺-pH5.0碳酸鹽-檸檬酸緩沖液）。8.終止液（2mol/LH2SO4)9.酶儀表、冰箱。實(shí)驗(yàn)步驟1.包被用0.05mol/LpH9.6碳酸緩沖液稀釋豚鼠Anti-HBs至50μg／ml，然后將稀釋好的豚鼠Anti-HBs用微量移液器加入反應(yīng)板，每孔0.2ml，放濕盒內(nèi)，置37℃溫育2h，在轉(zhuǎn)入4℃冰箱過夜。2.洗滌將包被液到掉后，用洗滌液（0.01mol/LpH7.4Tris-Cl-Tween20溶液洗滌3次，每次持續(xù)3min。3.加樣將待測(cè)血清用稀釋液（0.01mol/LpH7.4PBS）稀釋（從1：100、1：200至1：6400），然后用移液器分別加入1~7個(gè)孔，每孔0.1ml，第8孔加陽性對(duì)照血清，第9孔加陰性對(duì)照血清，第10孔加PBS做空白對(duì)照，將應(yīng)用板置于37℃孵育2h。4.洗滌同步驟2.5.加酶標(biāo)記物將酶標(biāo)記豚鼠Anti-HBs加入反應(yīng)板，每孔0.1ml，置37℃溫育2h。6.洗滌同步驟27顯色每孔加顯色液（臨用前配制）0.1ml，置37℃作用15min。8.終止反應(yīng)每孔加入2mol/LH2SO40.5ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果待測(cè)孔A值-空白對(duì)照孔A值陰性對(duì)照孔A值-空白對(duì)照孔A值P/N=當(dāng)P/N≥2.1時(shí)判為陽性，以出現(xiàn)陽性結(jié)果的最高血清稀釋孔的血清稀釋度為該血清的（HBs-Ag）效價(jià)。將反應(yīng)板置酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的光密度（A值或OD值），然后按下列公式計(jì)算，判斷陰陽性結(jié)果。注意事項(xiàng)1.包被緩沖液，洗滌液、稀釋液等可提前配制，于冰箱中短期保存，使用前觀察是否變質(zhì)。2.加樣量力求準(zhǔn)確，加樣時(shí)應(yīng)將液體加入孔底，避免加在孔壁上部，并出現(xiàn)氣泡。3.ELISA操作需要一定溫度孵育，為避免蒸發(fā)，酶標(biāo)板上應(yīng)加蓋，或?qū)⒚笜?biāo)板平放在底部墊有紗布的濕盒中。4.洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合物