本文格式為Word版，下載可任意編輯——抗菌藥物敏感性試驗(yàn)及細(xì)節(jié)耐藥檢測抗菌藥物敏感性試驗(yàn)與細(xì)節(jié)耐藥性監(jiān)測

來源：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)在線2023-4-15南網(wǎng)編輯2023-7-6

一、需氧菌及兼性厭氧菌的藥物敏感試驗(yàn)

(一)紙片瓊脂擴(kuò)散法

紙片瓊脂擴(kuò)散法又稱Kirby-Bauer試驗(yàn)，是操作最簡易、使用最廣泛的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。

1．試驗(yàn)原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周邊區(qū)域擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。在紙片周邊抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即抑菌圈越大，MIC越小。

2．培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片

(1)培養(yǎng)基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培養(yǎng)基是CLSI/NCCLS采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，pH值為7.2～7.4，對那些營養(yǎng)要求高的細(xì)菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌等需參與補(bǔ)充物質(zhì)。瓊脂厚度為4mm。配制瓊脂平板當(dāng)天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前應(yīng)將平板置35℃孵育箱孵育，使其表面枯燥。(2)抗菌藥物紙片：選擇直徑為6.35mm，吸水量為20ul的專用藥敏紙片用逐片加樣或浸泡方法使每片含量達(dá)到規(guī)定所示。含藥紙片密封儲(chǔ)存2～8℃或-20℃無霜冷凍箱內(nèi)保存，β-內(nèi)酰胺類藥敏紙片應(yīng)冷凍儲(chǔ)存，且不超過l周。使用前將儲(chǔ)存容器移至室溫平衡l～2h，避免開啟儲(chǔ)存容器時(shí)產(chǎn)生冷凝水。

3．細(xì)菌接種細(xì)菌接種采用直接菌落或細(xì)菌液體生長方法。用0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度。校正濃度后的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種完畢。接種步驟如下：①用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂片接種3次，每次旋轉(zhuǎn)60°，最終沿平板內(nèi)緣涂抹1周；②平板置室溫下枯燥3～5min，用紙片分開器或無菌鑷將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后閱讀結(jié)果，對甲氧西林和萬古霉素藥敏感試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)孵育24h。

4．結(jié)果判斷和報(bào)告用確切度為1mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑(抑菌圈的邊緣應(yīng)是無明顯細(xì)菌生長的區(qū)域)，當(dāng)葡萄球菌對苯唑西林的藥敏試驗(yàn)或腸球菌對萬古霉素的敏感試驗(yàn)，圍繞紙片周邊只要有極少細(xì)菌生長提醒為耐藥。對另外一些菌，在抑菌圈內(nèi)散在菌落生長提醒可能是混合培養(yǎng)，必需再分開鑒定及試驗(yàn)，也可能提醒為高頻突變株。變形桿菌遷徙生長使抑菌圈內(nèi)生成的薄層菌可忽略不計(jì)。由于培養(yǎng)基內(nèi)抗藥成分使其對甲氧芐啶引起的微弱細(xì)菌生長，生長層小于20％可忽略不計(jì)。根據(jù)CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，對量取的抑菌圈直徑判斷病原菌對該藥物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐藥)。

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(二)稀釋法

假使要進(jìn)一步檢測某種病原菌對多少劑量(濃度)的抗菌藥物呈敏感時(shí)，就必需使用稀釋法(dilutionmethod)。稀釋法包括兩

種：肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法，分別介紹如下：

1．肉湯稀釋法有常量稀釋法(mac-rodilution)和微量稀釋法(microdilution)，前者含藥肉湯含量每管≥l.0ml(尋常2m1)，后者每孔含0.1ml。商品化的微量稀釋板上含有多種經(jīng)對倍系列稀釋的凍干抗生素，操作便利，廣泛應(yīng)用于臨床。

(1)培養(yǎng)基：使用M-H肉湯，需氧菌、兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好。在該培養(yǎng)液中參與補(bǔ)充基質(zhì)可支持流感嗜血桿菌、鏈球菌生長。培養(yǎng)基制備完畢后應(yīng)校正pH值為7.2～7.4(25℃)。離子校正的M-H肉湯(CAMHB)為目前推薦的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)液。

(2)藥物稀釋①藥物原液制備：抗菌藥物直接購自于廠商或相關(guān)機(jī)構(gòu)，所需的溶液量或粉劑量可根據(jù)下述兩公式進(jìn)行計(jì)算。

質(zhì)量(mg)=溶劑（ml）×濃度（ug/ml）/分析效能（ug/mg）容積(m1)=質(zhì)量(mg)×分析效能（ug/mg）/濃度（ug/ml）

配制各種抗菌藥物的溶劑根據(jù)藥物性能選擇蒸餾水、pH值為6.0，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液等。

一般原液濃度不低于1000ug/ml或10倍于最高測試濃度，原液應(yīng)儲(chǔ)存于-60℃以下，保存期不超過6個(gè)月。②稀釋抗菌藥物的制備：行2倍系列稀釋，使其終濃度(ug/m1)為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125等。

(3)菌種接種：配制0．5麥?zhǔn)蠞舛染?，用肉?常量稀釋法)、蒸餾水或生理鹽水(微量稀釋法)稀釋菌液，使最終菌液濃度(每管或每孔)為5×10CFU／ml，稀釋菌液于15min內(nèi)接種完畢，35℃孵育16～20h，當(dāng)試驗(yàn)菌為嗜血桿菌屬、鏈球菌屬孵育時(shí)間為20～24h，試驗(yàn)葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古霉素的藥敏試驗(yàn)孵育時(shí)間必需滿24h以上。(4)結(jié)果判斷：以在試管內(nèi)或小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC(ug/m1)。甲氧芐啶(甲氧芐胺嘧啶)或磺胺藥物的肉湯稀釋法敏感試驗(yàn)的終點(diǎn)判斷，以細(xì)菌數(shù)為陽性對照的80％即可作為判斷細(xì)菌生長指標(biāo)。微量稀釋法時(shí)，常借助于比濁計(jì)判別是否有細(xì)菌生長。

2．瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法是將藥物混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細(xì)菌，經(jīng)孵育后觀測細(xì)菌生長狀況，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含藥物濃度測得MIC。

(1)培養(yǎng)基：M-H瓊脂為一般菌藥敏試驗(yàn)的最正確培養(yǎng)基，調(diào)整pH值在7.2～7.4(25℃)，過高或過低的pH值會(huì)影響藥物效能。

(2)含藥瓊脂制備：將已稀釋的抗菌藥物按1：9(配制的藥物溶液：瓊脂培養(yǎng)基)參與，加熱溶解瓊脂，在45～50℃水浴平衡溶化MH瓊脂中，充分混合傾入平皿，瓊脂厚度為3～4mm。室溫凝固后的平皿裝入密閉塑料袋中，置2～8℃，儲(chǔ)存日期為5d，對易降解藥物如含

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頭孢克洛，在使用48h之內(nèi)制備平板，使用前應(yīng)在室溫中平穩(wěn)放于孵育箱或?qū)恿髡种?0min以使瓊脂表面枯燥。

(3)細(xì)菌接種：將0.5麥?zhǔn)媳葷岫染合♂?0倍，以多頭接種器吸取(為1～2ul)接種于瓊脂表面，稀釋的菌液于l5min內(nèi)接種完畢，接種后置35℃孵育16～20h(MRS、VRE孵育時(shí)間需滿24h)，奈瑟菌屬、鏈球菌屬細(xì)菌置于5％C02、幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。(4)結(jié)果判斷：將平板置于暗色、無反光表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長的藥物稀釋度為終點(diǎn)濃度(含甲氧芐啶平板上可見少許散在細(xì)菌生長)。試驗(yàn)菌的結(jié)果報(bào)告可用MIC(ug/mg)或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報(bào)告。(三)E試驗(yàn)

E試驗(yàn)(Epsilometertest)是一結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理對細(xì)菌藥敏試驗(yàn)直接定量的技術(shù)。

1．試驗(yàn)原理E試條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度?？股氐奶荻瓤筛采w有20個(gè)MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍，其斜率和濃度范圍對判斷有臨床意義的MIC范圍和分界點(diǎn)值具有較好的關(guān)聯(lián)。

將E試條放在細(xì)菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗生素抑制細(xì)菌的特定濃度，又稱抑制濃度(IC)，它與MIC呈高度相關(guān)。

2．細(xì)茵接種和加樣使用厚度為4mmM-H瓊脂平板，用0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊膶?shù)期菌液涂布，待瓊脂平板完全枯燥，用E試驗(yàn)加樣器或鑷子將試條放在已接種細(xì)菌的平板表面，試條全長應(yīng)與瓊脂平板緊湊接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。采用CLSl/NCCLSAST執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦孵育條件。

3．結(jié)果判斷和報(bào)告讀取橢圓環(huán)與E試驗(yàn)試條的交界點(diǎn)IC值。E試驗(yàn)IC值與CLSl/NCCLS的稀釋法MIC參考值高度相關(guān)，二者直接相對應(yīng)，CLSl/NCCLSMIC折點(diǎn)值適用于E試驗(yàn)。但在判斷結(jié)果時(shí)出現(xiàn)和細(xì)菌、藥物、耐藥機(jī)制和技術(shù)處理有關(guān)判斷問題時(shí)應(yīng)予以修正。

二、苛養(yǎng)菌的藥物敏感試驗(yàn)

肺炎鏈球菌及其鏈球菌屬、流感嗜血桿菌、奈瑟菌屬等苛養(yǎng)菌不能在普通環(huán)境及普通MH培養(yǎng)基中快速生長，上述的藥敏試驗(yàn)條件不適合它們。它們需要更為繁雜的培養(yǎng)基、孵育條件，在進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，質(zhì)控菌株、藥敏抗生素的選擇、結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)也有所不同。下面分別介紹幾種重要苛養(yǎng)菌藥敏試驗(yàn)的試驗(yàn)條件選擇、質(zhì)量控制方法和結(jié)果判斷本卷須知。各自的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)請參考CLSl/NCCLS手冊。(一)嗜血桿菌屬1．試驗(yàn)條件

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(1)培養(yǎng)基：使用嗜血桿菌屬試驗(yàn)培養(yǎng)基(hemophilustestmedium，HTM)。(2)接種菌液：菌懸液終濃度為5×10CFU/ml。

(3)孵育條件：35℃下孵育20～24h觀測結(jié)果。對于擴(kuò)散法，35℃、5％～7％C02下孵育l6～18h觀測結(jié)果。

2．質(zhì)量控制流感嗜血桿菌ATCC49247、流感嗜血桿菌ATCC49766、大腸埃希菌ATCC35218(用于β-內(nèi)酰胺抗生素/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑)為推薦參考菌株。3．結(jié)果判斷本卷須知

(1)血液、腦脊液分開株僅需做氨芐西林、三代頭孢菌素中的一種、氯霉素和美羅培南。(2)耐氨芐西林和阿莫西林的流感嗜血桿菌大多產(chǎn)TEM型β-內(nèi)酰胺酶。大多數(shù)狀況下，直接檢測β-內(nèi)酰胺酶更快。

(3)β-內(nèi)酰胺酶陰性而氨芐西林耐藥(β-Lactmase-negative，ampicillin-resistant，BL-NAR)的流感嗜血桿菌株少見。然而，不管其體外藥敏試驗(yàn)是否出現(xiàn)敏感，均應(yīng)考慮為阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、頭孢克洛、頭孢盂多、頭孢尼西、哌拉西林/他唑巴坦耐藥。

(二)肺炎鏈球菌1．試驗(yàn)條件

(1)培養(yǎng)基：肉湯稀釋法使用離子校正的馬凍融血培養(yǎng)基。(2)接種菌液：菌懸液終濃度為l0CFU/ml。(3)孵育條件：35℃下孵育20～24h。

2．質(zhì)量控制肺炎鏈球菌ATCC49619、大腸埃希菌ATCC35218(用于β-內(nèi)酰胺抗生素/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑)為推薦參考菌株。3．結(jié)果判斷本卷須知

(1)對青霉素敏感者，均可認(rèn)為對氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、阿莫西林／舒巴坦、頭孢克洛等三代頭孢菌素敏感；青霉素中介或耐藥株，不推薦做上述藥物的藥敏試驗(yàn)，由于對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌對上述抗生素治療的療效很低。應(yīng)當(dāng)及時(shí)通知臨床醫(yī)生，然后應(yīng)報(bào)告對頭孢曲松、頭孢噻肟和美羅培南的MIC。

(2)靜脈注射高濃度青霉素(腎功能正常的成人2×10U/4h)或氨芐西林(29/6h)對青霉素中介的肺炎鏈球菌是有效的。標(biāo)準(zhǔn)劑量的頭孢曲松、頭孢噻肟對中介的肺炎鏈球菌也有臨床療效，但在發(fā)現(xiàn)該菌株引起的腦膜炎時(shí)常用最大劑量治療。(三)肺炎鏈球菌外鏈球菌屬1．試驗(yàn)條件

(1)培養(yǎng)基：肉湯稀釋法同肺炎鏈球菌，瓊脂稀釋法用含5％羊血瓊脂。(2)接種菌液：菌懸液終濃度為5×10CFU/ml。

(3)孵育條件：35℃下孵育20～24h。瓊脂稀釋法需5％C0。。2．質(zhì)量控制肺炎鏈球菌ATCC49619為推薦質(zhì)控菌株。

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3．結(jié)果判斷本卷須知

(1)化膿性鏈球菌一般不需做青霉素藥敏試驗(yàn)，該菌目前對青霉素仍為敏感株，只有某些無乳鏈球菌可能會(huì)對青霉素產(chǎn)生中介結(jié)果。

(2)對青霉素敏感的鏈球菌，同時(shí)被認(rèn)為對氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、阿莫西林/舒巴坦、頭孢克洛、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑肟等敏感，毋需對這些抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

(3)青霉素或氨芐西林中介的菌株，需用氨基糖苷類聯(lián)合用藥進(jìn)行治療。

(4)對紅霉素耐藥者或敏感者常提醒對阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素耐藥或敏感。

三、分枝桿菌的藥物敏感試驗(yàn)

(一)結(jié)核及慢生長分枝桿菌的藥物敏感試驗(yàn)

由于結(jié)核及慢生長分枝桿菌生長緩慢，在生長前，藥物已擴(kuò)散至培養(yǎng)基中，不能有效影響其生長。故不適用于需氧或兼性厭氧菌的藥敏試驗(yàn)。結(jié)核及慢生長分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的藥敏培養(yǎng)基、含藥濃度、接種菌量、結(jié)果解釋等都有其特別性。

比例法是WH0/IUATLD全球結(jié)核病耐藥監(jiān)測方案中推薦的方法，目前國外普遍采用此法。國內(nèi)多采用絕對濃度法，據(jù)報(bào)道，該法比比例法的耐藥菌檢出率要低5％～10％。某些微生物自動(dòng)鑒定和藥敏系統(tǒng)則采用放射核素等方法。

1．絕對濃度法(absoluteconcentrationmethod)該法以“無生長〞為終點(diǎn)或?yàn)樽畹鸵志鷿舛?MIC)來判斷耐藥與否，每種藥物需制備兩種不同濃度的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)用不含藥培養(yǎng)基作