結(jié)核桿菌的最新研究進展CompanyLogo結(jié)核桿菌的介紹1結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展2CompanyLogo結(jié)核桿菌的介紹自從1882年RobertKoch發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌(MTB)以來，已報道的分枝桿菌有100多種。有關(guān)分枝桿菌的分類方法很多，通常分為典型結(jié)核分枝桿菌(TM)和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。TM包括人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌、非洲結(jié)核分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，又稱為結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC).該群中DNA相關(guān)性為85％一100％，分類地位相近。NTM包括MTBC和麻風分枝桿菌以外的所有其他分枝桿菌，在自然界中分布廣泛，由于NTM對氯化物具有抗性，它們甚至可以在自來水管道系統(tǒng)中生存。CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展一、細菌學檢測結(jié)核病人的細菌學檢測是結(jié)核病診斷、治療及評價治療效果的可靠手段。在過去的20年中，針對結(jié)核分枝桿菌的早期感染已經(jīng)建立了一系列快速檢測系統(tǒng)。1、全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)（BACTEC）該法采用放射同位素技術(shù)對細菌的生長進行自動檢測。該法檢測的陽性率比L-j法提高了10％，但其局限性在于無法觀察菌落形態(tài)、容易污染、有放射性及價格昂貴。CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展2、分枝桿菌生長指示系統(tǒng)(MGIT)MGIT系統(tǒng)是繼全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)(BACTIEC)檢測系統(tǒng)之后發(fā)明的一種非放射性培養(yǎng)法，包括MiddleBrood7H9液體培養(yǎng)基和分枝桿菌生長指示劑，該指示劑在有氧條件下發(fā)生熒光淬滅。當培養(yǎng)基中分枝桿菌生長代謝逐漸消耗氧時，培養(yǎng)基的氧化還原電勢降低，指示劑發(fā)出熒光．這樣可通過紫外線透射儀觀察，分枝桿菌生長所產(chǎn)生的熒光在氣液面及試管底部呈橙色即為陽性結(jié)果。CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展3、MB／BacT系統(tǒng)

MB／BacT系統(tǒng)是由德國Heipha—Biotest公司生產(chǎn)的一種液體培養(yǎng)基系統(tǒng)，該系統(tǒng)對標本中結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)初代分離率高于全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)(BACTE)TB460，可以通過肉眼觀察到細菌生長，且無放射性污染.但不能用于分支桿菌的菌型鑒定。CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展二、血清學檢測

多數(shù)血清學實驗檢測時間短，具有較高的特異性。可用于人群篩選。但日前已商品化的組合抗原檢測試劑盒都無法檢測出所有結(jié)核患者血清中的抗結(jié)核抗體。結(jié)核分枝桿菌抗原多且復雜，在宿主體內(nèi)表達的數(shù)量、種類或時機可能隨患者的個體免疫背景和病程而異，從而表現(xiàn)出不同的抗體譜。因此，采用多種抗原聯(lián)合檢測的手段，在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于改善靈敏低的缺點。CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展1、酶聯(lián)免疫吸附法

由于酶聯(lián)免疫吸附法(ELSA)簡使、易行、快速、無需特殊精密儀器，所以在結(jié)核病血清學診斷方面研究最多、應用最廣。CompanyLogo

2、斑點金標免疫滲濾法

斑點金標免疫滲濾法(DIGFA)是將固相人型結(jié)核分枝桿菌蛋白衍生物(PPD)純化抗原包被在斑點反應板上，其與體液中的抗結(jié)核分枝桿菌抗體(PPD—IgG)形成復合物．膠體金標記抗人IgG或海藻硫酸多糖(SPA)與復合物結(jié)合，形成肉眼可見的紅色斑點。這種方法具有簡便、快速、結(jié)果易于判讀、無需特殊儀器、能進行單個標本的測定、受檢患者可及時得到結(jié)果等特點。但受結(jié)核菌或其他分枝桿菌感染及卡介苗接種等影響，可能出現(xiàn)交叉反應。結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展三、分子生物學診斷方法1、結(jié)核桿茵DNA擴增法(PCR法)在過去的20年，已建立起多種PCR技術(shù)用來檢測結(jié)核分枝桿菌特異性的靶序列。實驗證明，PCR是一種簡便、快速、靈敏、特異的基因診斷技術(shù)，特別適用于因排菌量少、結(jié)核桿菌發(fā)生L型變異而被常規(guī)細菌學檢查漏診者的早期診斷、鑒別診斷及化療后排菌情況的觀察，標本不需要預培養(yǎng)，有很高的臨床診斷價值。雖然PCR技術(shù)有諸多好處，但是目前該方法仍缺少權(quán)威性的診斷試劑盒，存在的主要問題是擴增時氣溶膠污染導毀的假陽性、標本中PCR抑制物質(zhì)導致的假陰性，因此還有待進一步改進。CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展2、實時熒光定量PCR技術(shù)實時熒光定量PCR技術(shù)具有引物和探針的雙重特異性。與傳統(tǒng)PCR相比，在對結(jié)核分枝桿菌檢測的特異性上大為提高。盡管實時熒光定量PCR技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測方面有許多優(yōu)勢，但由于其高靈敏性、實驗操作易受污染等而容易出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性結(jié)果，故并不能作為診斷依據(jù)，只有當一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義。CompanyLogo結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展3、限制性片段長度多態(tài)性（PCR—RFLP）分子生物學診斷方法PCR—RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)是以PCR為基礎(chǔ)的分類鑒定技術(shù)和限制性內(nèi)切酶分析相結(jié)合的技術(shù)。PCR—RFlJP分析是鑒定分枝桿菌種的可靠程序，比形態(tài)學和生理、生化特征等常規(guī)方法更準確，快速。CompanyLogo5、生物芯片檢測生物芯片(又稱DNA芯片、基因芯片)。該方法適用于基因表達、基因功能、基因分型和序列分析等的研究?；蛐酒云錈o可比擬的信息量、高通量及快速、準確地分析基因的本領(lǐng)，在結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥性監(jiān)測、基因組比較分析等方面發(fā)揮著重要的作用，但由于儀器昂貴和制備芯片成本偏高等因素限制了其普及。結(jié)核桿菌診斷技術(shù)研究進展CompanyLogo結(jié)核疫苗研究進展結(jié)核疫苗的研究策略目前，研究疫苗的總體思路來說，主要分為以下三種。第一種策略將一些重要的抗原或者其它因子重新導入到現(xiàn)有的BCG株，得到一個以BCG為載體的重組BCG疫苗，或者使結(jié)核分枝桿菌的基因缺失得到基因缺失突變株從而制造出新的結(jié)核疫苗，取代我們傳統(tǒng)用的BCG，這種方法制備的結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗可顯著地表達多種抗原并激活各T細胞群聯(lián)合免疫。作為臨床試驗的候選，這種疫苗肯定會比BCG更有效，更安全。CompanyLogo結(jié)核疫苗研究進展第二種策略是對已接種卡介苗的兒童進行強化免疫，進而加強免疫應答并將免疫保護力延續(xù)至成人階段。這一策略目前公認的最佳方案是應用亞單位疫苗加強免疫。亞單位疫苗組成明確，結(jié)構(gòu)簡單，可應用于有免疫缺陷的人群，倍受人們關(guān)注。亞單位疫苗主要是由有限數(shù)量的抗原構(gòu)成，所引起的保護性免疫應答也高度集中。但其在體內(nèi)滯留時間短，免疫應答的持續(xù)時間也較短，必須與佐劑聯(lián)用才有效，使其應用受到限制，幾種主要的候選疫苗均采用了將單抗原與多聚蛋白融合的方法，這樣不僅增強了單抗原的免疫力，也易于進行規(guī)?；a(chǎn)。所以佐劑的發(fā)展對強化免疫策略的實現(xiàn)功不可沒。CompanyLogo結(jié)核疫苗研究進展從疫苗結(jié)構(gòu)完整性來看一般可分為：重組BCG、亞單位疫苗、DNA疫苗基因和缺失疫苗等。CompanyLogo結(jié)核疫苗研究進展1、重組弱毒疫苗主要包括基因缺失弱毒疫苗和以BCG為載體的重組疫苗。rBCG30是一種經(jīng)過基因改造的卡介苗。比BCG能產(chǎn)生更強的免疫應答。rBCG30已經(jīng)通過臨床1期試驗，人體對其顯示了良好的耐受性[12]。rBCG△reC:Hly德國柏林Max-Planck研究所研發(fā)的攜帶李斯特菌溶解素（Hly）而自身尿素酶C基因缺乏的重組BCG?；蛱蕹呙鏘CL營養(yǎng)缺陷株疫苗該疫苗可用于HIV感染者而不引起相關(guān)性疾病。正在研制的該類疫苗約有9種，在動物實驗中均有一定的保護效果，但持續(xù)時間短，免疫記憶差，且毒力尚不確定。CompanyLogo結(jié)核疫苗研究進展2、亞單位基因工程疫苗Ag85B-ESAT6融合蛋白（Hybrid1）和Ag85B-TB10.4融合蛋白（Hybrid4）

熱休克蛋白疫苗（J774-HSP65，BMC-HSP65）MTB72f.利用表現(xiàn)為Rv0125(MTB39)和Rv1196(MTB32)融合蛋白質(zhì)配合免疫佐劑（AS02A，AS01B）。MVA-85A.利用自己不復制的痘苗病毒為載體,表達出具有強免疫原性的結(jié)核桿菌Ag85A抗原的基因疫__苗重組，從而在兒童中獲得預防結(jié)核病的長久免疫保護效果。在技術(shù)上只是為了增強卡介苗的效果。CompanyLogo結(jié)核病疫苗的未來展望最近幾年由于結(jié)核病的死灰復燃，引起社會各界的廣泛關(guān)注。隨著來自公共基金如歐盟、政府衛(wèi)生機構(gòu)基金的投資的不斷增加，結(jié)核疫苗的研究、開發(fā)和評估已經(jīng)成為熱點，并且?guī)追N疫苗已進入早期臨床階段。當BCG的保護性捉襟見肘時，基因疫苗開始成為了科學家們關(guān)注和研究的焦點。1998年，英國的Sanger中心和法國Pasteur研究所聯(lián)合完成了人肺結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組序列圖，這就為更好的研究新型疫苗奠定了一定的基礎(chǔ)。大概再過2年的時間，科學家預計在2010年將