本文格式為Word版，下載可任意編輯——聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗(yàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

一、目的要求

（1）學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)

（2）學(xué)習(xí)和把握SDS－聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳分開蛋白質(zhì)技術(shù)

二、試驗(yàn)原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）通過化學(xué)催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳一般可分成12～25個組分。因此適用于不同相對分子質(zhì)量物質(zhì)的分開，且分開效果好。

聚丙烯酰胺凝膠作為電泳材料的特性

人工合成聚丙烯酰胺凝膠的化學(xué)體系的組成及功能：Acr：丙烯酰胺

Bis：甲叉雙丙烯酰胺

AP：過硫酸銨——化學(xué)催化劑

TEMED：四甲基乙二胺——加速劑

SDS是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。在含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的―外衣‖，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用。

三、試驗(yàn)材料

（一）試劑

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis為29:1）稱取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去離子水溶解并稀釋至100ml，貯棕色瓶中于4℃保存，可用一個月。

2、1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液取1mol/LHCL溶液48ml、三羥甲基甲烷（Tris）36.6g，加雙蒸餾水至80ml使其溶解，調(diào)pH至8.8，然后用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液取1mol/LHCL溶液48ml，Tris5.98g，加雙

蒸餾水至80ml，調(diào)pH6.8，用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4℃貯存。

4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液稱取Tris6g、甘氨酸28.8g，加蒸餾水850ml，調(diào)pH至8.3，加蒸餾水到1000ml，4℃貯存。用時可做10倍稀釋。

5、10%過硫酸銨（AP）

6、10%SDS（十二烷基磺酸鈉）稱取SDS10g，加蒸餾水100ml使其溶解。

7、四甲基乙二胺（TEMED）8、上樣緩沖液取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液6.25ml，蔗糖10g，SDS2.3g，1g/L溴酚藍(lán)10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。

9、考馬斯亮藍(lán)染色試劑考馬斯亮藍(lán)R250染色液：濃度為2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸餾水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。

10、脫色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸餾水至100ml。

11、樣品：人血清。

12、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物市售中分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。也可選擇5種以上的已知分子量蛋白質(zhì)自行配制，注意其分子量分布要能滿足需要，各種蛋白質(zhì)的濃度基本相等。

（二）儀器圓盤電泳槽（或垂直板電泳槽）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、脫色搖床。

四、試驗(yàn)方法

（一）準(zhǔn)備圓盤電泳槽、電泳儀。

（二）凝膠制備按下表分別配制分開膠和濃縮膠（此量可供2人用）

分開膠(12%5ml)濃縮膠(5%2ml)ddH2O1.6ml1.4ml30%混合液2.0ml0.33ml

1.5mol/LpH8.8Tris-HCl1.3ml1.0mol/LpH6.8Tris-HCl0.25ml10%SDS50μl20μl10%Ap50μl20μlTEMED4μl4μl

注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速用滴管灌膠

（三）灌膠

1、先將膠管（5х90mm）封好底，將配制好的分開膠液灌注入膠管內(nèi)，約70mm高度（把握分開膠的高度），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm）。用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀測膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。要在確認(rèn)分開膠完全凝固后才開始配制濃縮膠。

2、分開膠凝固好后，倒掉覆蓋在分開膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸凈殘留的水。將配制好的濃縮膠液灌注入膠管內(nèi)（約15mm），在凝膠表面輕輕加一層正丁醇液（約3～4mm），用于隔絕空氣，使膠面平整。室溫下靜置約30～60min。觀測膠和正丁醇之間的界面，判斷膠是否凝固。膠凝固好后，倒掉覆蓋在膠表面的正丁醇，并用去離子水沖洗一次，倒置吸凈殘留的水，準(zhǔn)備加樣。

（四）樣品預(yù)處理和加樣

1、取血清0.1ml、上樣緩沖液0.9ml，混勻，在沸水中煮沸5min。

2、將膠管封底去掉，放入圓盤電泳槽中，套緊，不能有空的孔，將Tris-甘氨酸電泳緩沖液參與圓盤電泳上、下槽中，電泳緩沖液要蓋過膠管口，然后用微量加樣器（或注射器）將樣品10μl加到膠管膠面內(nèi)。

（五）電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，先調(diào)電壓為120v/濃縮膠，開始電泳，當(dāng)指示染料進(jìn)入分開膠后，將電壓增加到80v/分開膠膠，繼續(xù)電泳直至染料抵達(dá)距分開膠下端約1cm處，中止電泳，斷開電源。電泳時間約1.0~1.5h。

（六）考馬斯亮藍(lán)染色

電泳終止后，取出電泳膠管，用長注射器針剝膠，一邊注水一邊推膠，直至膠出。將膠移至大培養(yǎng)皿中，確切量取并記錄凝膠長度和指示染料的遷移距離（分開膠上緣到染料條帶中心距離），然后將凝膠板浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中0.5-1h，再用脫色液脫色1~2天，至背景無色為止。區(qū)帶可作定性或定量分析。

（七）校正曲線的數(shù)據(jù)處理和分子量測定確切量取并記錄染色后凝膠長度、各標(biāo)志蛋白質(zhì)和各待測蛋白質(zhì)區(qū)帶的遷移距離（分開膠上緣到各蛋白質(zhì)區(qū)帶中心）。按下式計算各蛋白質(zhì)的相對遷移率（Rm值）。

在半對數(shù)紙上，以各標(biāo)志蛋白質(zhì)的Rm值為橫坐標(biāo)（普通尺度），相應(yīng)的分子量為縱坐標(biāo)（對數(shù)尺刻度）作圖，即得分子量校正曲線。根據(jù)各待測蛋白質(zhì)的Rm值，查此校正曲線，可求各待測蛋白質(zhì)的相對分子量。

五、本卷須知

1．制膠過程中用正丁醇封住膠面是為了阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。

2．本法也適合于其他生物樣品中蛋白質(zhì)的分析。上樣量不宜過大，否則會出現(xiàn)過載現(xiàn)象。特別是考馬斯亮藍(lán)R250染色，在蛋白質(zhì)濃度過高時，染料與蛋白質(zhì)的氨基(－NH)形成的靜電鍵不穩(wěn)定，其結(jié)合不符合Beer定律，使蛋白質(zhì)量不確鑿。

3．Acr和Bis有神經(jīng)毒性，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，故操作時要注意保護(hù)。

附表1分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)核酸(RNA)分子量范圍適用的凝膠濃度/(%)分子量范圍適用的凝膠濃度/(%)5×10515–205-102-2.62-5不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理

本試驗(yàn)采用不連續(xù)的聚丙烯酸胺凝膠電泳分開小麥苗過氧化物酶同工酶。系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：

（1）凝膠層的布連續(xù)性：凝膠由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分開膠。

（2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH的布連續(xù)性：本試驗(yàn)采用堿性系統(tǒng)，電極緩沖液為pH8.9的Tris一HCl緩沖液，濃縮膠和分開膠緩沖液均為Tris一HCl緩沖液，但pH值分別為6.7和8.9。

（3）電位梯度的不連續(xù)性：由于pH的不連續(xù)性，在電場中形成了不連續(xù)的電位梯度。（詳見后述）

在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。在這三種效應(yīng)的共同作用下，待分開的物質(zhì)很好地分開。

下面以本試驗(yàn)要分開的小麥過氧化物酶同工酶為例，分別說明這三種效應(yīng)的作用：

（1）電荷效應(yīng)：各種酶蛋白按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場作用下向一定電極，以一定速度泳動。

（2）分子篩效應(yīng)：分子量小，形狀為球形的分子在電泳過程中受到阻力較小，移動較快，反之，分子量大，形狀不規(guī)則的分子，電泳過程中受到的阻力較大，移動較慢。

（3）濃縮效應(yīng)：待分開樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。其原因如下。①由于兩層凝膠孔徑不同，酶蛋白向下移動到兩層凝膠界面時，阻力突然加大，速度變慢。這樣，就在兩層凝膠交界處使待分開的酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。②在聚丙烯酰胺凝膠板中，雖然濃縮膠和分開膠用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠的pH為6.7，下層分開膠的pH為8.9。HCl是強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl-布滿整個膠板。待分開的酶蛋白樣品加在頂層，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開始，有效泳動率最大的Cl-迅速跑到最前邊，成為快離子（前導(dǎo)離子）。在pH6.7條件下解離度僅有0.1-1.0%的甘氨酸有效泳動率最低，跑在最終邊，成

為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個不斷移動的界面。在pH6.7條件下帶有負(fù)電荷的酶蛋白，其有效泳動率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個區(qū)帶。由于快離子快速向前移動，在其原來停留的那部分地區(qū)成了低離子濃度區(qū)，即低電導(dǎo)區(qū)。由于電位梯度V、電流強(qiáng)度1和電導(dǎo)率S之間有如下關(guān)系：

V＝I/S

所以在電流恒定條件下低電導(dǎo)區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高的電位梯度。這種在電泳開始后產(chǎn)生的高電位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追趕快離子。本來夾在快慢離子之間的酶蛋白區(qū)帶，在這個追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。這就是所謂的濃縮效應(yīng)。在此區(qū)帶中，各種酶蛋白又按其電荷而分成不同層次，在進(jìn)入分開膠前被逐步分開，形成若干條離得很近但又不