1前言自2018年我國(guó)發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟后，我國(guó)生豬存欄量急劇下降，導(dǎo)致市場(chǎng)上的豬肉流通量減少，豬肉價(jià)格不斷上漲。本人在實(shí)習(xí)期間對(duì)于非洲豬瘟有了一定了解，只要及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒并做出相對(duì)應(yīng)計(jì)劃，這樣就能很大程度上的減少非洲豬瘟病毒對(duì)豬場(chǎng)的影響。本設(shè)計(jì)主要以郴州汝城地區(qū)三星工業(yè)園的豬場(chǎng)為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)其非洲豬瘟病毒的檢測(cè)進(jìn)行方案設(shè)計(jì)。2實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)配配液室提取室擴(kuò)增室過道通風(fēng)口對(duì)于非洲豬瘟，實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法是熒光定量PCR檢測(cè)法，該方法靈析3.1采樣通道、車輛、門口、人員、廚房、飼料、水源、死豬、病豬、豬群、其次，采樣時(shí)應(yīng)注意防止人為污染，采樣員需戴好PE手套，對(duì)執(zhí)行人十人物品施四中轉(zhuǎn)照1-工男能我隱源轉(zhuǎn)司指財(cái)上要隔再24小后勤主蠟端內(nèi)中轉(zhuǎn)四日勤主管墻輕熱工作臟白色模行人棲行項(xiàng)口齒行項(xiàng)日扶行人壁配*8~執(zhí)行項(xiàng)目執(zhí)行項(xiàng)日熱行項(xiàng)目熱開項(xiàng)口執(zhí)行人減纏試3.1.1前處理采樣后，對(duì)樣品進(jìn)行分類、標(biāo)記、編號(hào)并記錄在表上，如果當(dāng)天樣品很多，能夠?qū)⑵鋬蓚€(gè)樣品進(jìn)行合樣后再進(jìn)行檢測(cè)，這里需要注意的是，允許合樣的樣品最多只能是兩個(gè)，因?yàn)楹蠘拥臉悠愤^多，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。不同的樣本有不同的前處理，如下表：樣品類型前處理方式核酸提取病料組織分樣、研磨均勻200ul懸液全血/血漿/血清抗凝/促凝、分離上清拭子浸泡、取上清200ul上清液唾液離心、除雜質(zhì)200ul上清液精液液化、凍融、離心200ul上清液病毒培養(yǎng)物、疫苗一般直接用于提取200ul懸液飼料樣本粉碎后浸泡15~30分鐘200ul上清液前處理完后，取200ul上清液/懸液與20ul裂解液依次加入核酸提取試劑盒中，我們所采用的試劑盒提取核酸的方法為磁珠法。通過磁珠法我們能夠從血液、動(dòng)物組織、病原微生物等樣本中分離出DNA最后，將核酸提取試劑盒放入核酸提取儀按所設(shè)程序相對(duì)應(yīng)時(shí)間等待核酸提取完成即可。3.2配液從非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(PCRMIX),融化后8000rpm離心10s。向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15ulPCR反應(yīng)液，再向已經(jīng)加入PCR反應(yīng)液的每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(PTC)5ul,放入漩渦震蕩儀中震蕩5～10秒，再7000rpm瞬時(shí)離心5s。這里需要注意的而引起重大污染。PCR反應(yīng)管中不能有氣泡，氣泡會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.3擴(kuò)增及結(jié)果分析將已經(jīng)加入反應(yīng)液和樣品的pcr反應(yīng)管放入熒光定量pcr檢測(cè)儀。常陰性樣品放大曲線的最高點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)成立的情況下，CT值小于等于35的樣本為陽(yáng)性，它的擴(kuò)增曲線也表現(xiàn)出明顯擴(kuò)增趨勢(shì)，表明該核酸陽(yáng)性；CT值大于40或顯示為無的樣品為陰性，表明核酸陰性；若CT值在35~40之間，則判為可疑樣品。此類樣品需要重新抽提核(如圖所示，精液包裝盒樣品末尾出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增曲線，且CT為35.01,在可疑范圍，說明該樣品需要復(fù)檢。而復(fù)檢后仍出現(xiàn)了明顯擴(kuò)增曲線，證明該樣品可判斷為陽(yáng)性。)興興(1)用酒精擦拭移液器(2)用84消毒液將實(shí)驗(yàn)臺(tái)面擦拭干凈(3)用核酸清除劑對(duì)瞬時(shí)離心機(jī)和核酸提取儀進(jìn)行擦拭(4)清理垃圾，紫外燈開半小時(shí)(5)離心管板和鑷子用84消毒液浸泡半小時(shí)，后用清水清洗干凈、晾干場(chǎng)所(污染嚴(yán)重的地方),也有可能將病毒攜帶回來。(1)應(yīng)該嚴(yán)格控制人員、車輛進(jìn)出，進(jìn)出的人員、物品、車輛均要(2)所有人員不管進(jìn)出還是休假在進(jìn)入豬場(chǎng)前都需要隔離。(3)若發(fā)現(xiàn)死豬或病豬需及時(shí)送檢并采取措施。(4)不從外面購(gòu)買豬肉制品以