實(shí)驗(yàn)二經(jīng)口急性毒性LD50測(cè)定一、試驗(yàn)?zāi)康?.熟悉急性毒性LD50測(cè)定的劑量設(shè)計(jì)2.掌握小鼠灌胃技術(shù)3.掌握改進(jìn)寇氏法計(jì)算LD50的方法二、試驗(yàn)原理選擇健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，依據(jù)LD50計(jì)算的設(shè)計(jì)原則，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成數(shù)個(gè)染毒組和一個(gè)陰性對(duì)照組。一次或24小時(shí)內(nèi)多次給予實(shí)驗(yàn)組受試物后，觀察動(dòng)物所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。根據(jù)受試物毒性反應(yīng)與劑量的關(guān)系，求出半數(shù)致死劑量（LD50），并根據(jù)LD50值將受試物進(jìn)行急性毒性分級(jí)。三、材料和試劑1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年小鼠60只，雌雄各半2.器材：灌胃針（小鼠適用）、注射器、吸管、容量瓶、燒杯、滴管、分析天平、臺(tái)秤、外科手術(shù)剪、鑷子3.受試物：（敵百蟲或克佰威）4.染色劑：苦味酸酒精飽和溶液、0.5%品紅溶液四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重、編號(hào)和隨機(jī)分組2.染毒劑量設(shè)計(jì)及試劑配制3.小鼠灌胃染毒技術(shù)4.毒性反應(yīng)的觀察及LD50計(jì)算五、試驗(yàn)方法（一）預(yù)實(shí)驗(yàn)1.探索劑量范圍先找出100%與0%的致死量（或陽(yáng)性反應(yīng)的劑量）為實(shí)驗(yàn)的上、下限劑量（Dmax和Dmin）。據(jù)經(jīng)驗(yàn)或文獻(xiàn)定出一個(gè)估計(jì)量，取動(dòng)物若干，每4只一組，按估計(jì)量給藥，如出現(xiàn)4/4死亡時(shí)，下一組劑量降低，當(dāng)出現(xiàn)3/4死亡時(shí)，則上一劑量為Dmax；如降低一檔劑量出現(xiàn)的死亡率2/4或1/4時(shí)，應(yīng)考慮到4/4死亡劑量組在正式實(shí)驗(yàn)時(shí)可能出現(xiàn)死亡率低于70%，為慎重起見(jiàn)可將4/4死亡劑量乘以1.4倍，作為Dmax。以次類推，找出Dmin。2.劑量分組一般染毒組數(shù)（G）以5-8組為宜，組間劑量比值為r。在確定組數(shù)后，按下列公式計(jì)算r。r=(Dmax/Dmin)1/(G-1)3.受試物溶液的配制配制等比濃度的敵百蟲溶液，并使每只動(dòng)物在給藥容量上相等（如0.5ml/20g）。劑量按等比級(jí)數(shù)增減，相鄰兩劑量比值1:0.6～0.9，設(shè)5個(gè)劑量組。（二）正式試驗(yàn)1.動(dòng)物的分組1.1區(qū)分性別辨別小鼠性別，并將雌雄動(dòng)物分開放入不同籠具中。1.2稱重稱量并記錄每只小鼠的體重，要求小鼠體重在20±2g范圍內(nèi)。1.3編號(hào)小鼠稱重后，立即以染色法編號(hào)。用苦味酸酒精飽和溶液（黃色）標(biāo)記個(gè)位數(shù)號(hào)碼，品紅（紅色）標(biāo)記十位數(shù)號(hào)碼。一般以頭部為1號(hào)，按順時(shí)針依次右前肢為2號(hào)，右腰為3號(hào)，右后肢為4號(hào)，尾根部為5號(hào)，右后肢為6號(hào)，左腰為7號(hào)，左前肢為8號(hào)，后背為9號(hào)，10號(hào)為在頭部染紅色標(biāo)記，11號(hào)在右前肢染紅色和黃色標(biāo)記各一，依次類推。1.4分組從隨機(jī)數(shù)字表上抄錄30個(gè)隨機(jī)數(shù)字，分別除以6（因?yàn)橐獙?dòng)物分成6組），寫下余數(shù)。如果被除數(shù)小于除數(shù)，商數(shù)為0，那么被除數(shù)即為余數(shù)；如果被除數(shù)為0，余數(shù)亦為0。然后按余數(shù)分組：余數(shù)為1，即將動(dòng)物歸入第一組；余數(shù)為2，歸入第二組；以此類推，余數(shù)為0，歸入第六組。請(qǐng)分別將動(dòng)物的分組情況填入實(shí)驗(yàn)報(bào)告的表1和表2中。如各組動(dòng)物數(shù)不等，則需調(diào)整。調(diào)整時(shí)，仍從隨機(jī)數(shù)字表中抄錄若干隨機(jī)數(shù)字，然后用待調(diào)整組動(dòng)物數(shù)去除該隨機(jī)數(shù)字，以決定將哪一只動(dòng)物調(diào)整至其他組。如隨機(jī)數(shù)字分別為83、89。而待調(diào)整組動(dòng)物數(shù)為8，先用8去除83，得余數(shù)為3，于是將該組的第3只動(dòng)物調(diào)至其他組。再用7（因待調(diào)整組還剩7頭動(dòng)物）去除89，得余數(shù)為5，于是將該組的第5只動(dòng)物調(diào)整至其他組，余類推。計(jì)算各組動(dòng)物的平均體重，同一次實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物體重變異不應(yīng)超過(guò)平均體重的20%。2.劑量設(shè)置本次實(shí)驗(yàn)采用改良寇氏法，分5個(gè)染毒劑量組，由教師指導(dǎo)同學(xué)進(jìn)行染毒劑量設(shè)計(jì)。3.受試物的配制3.1量取受試物：固體化學(xué)物采用稱量法，液體化學(xué)物可用稱量法或吸量法。3.1.1稱量法：準(zhǔn)確稱取一定量的受試物，放入燒杯中，加溶劑溶解或稀釋，倒入刻度容器（如容量瓶）內(nèi)，混勻，再加溶劑定容。計(jì)算受試物濃度（mg/m1），備用。3.1.2吸量法：依設(shè)計(jì)劑量計(jì)算出應(yīng)吸取液態(tài)受試物的容積，加入容量瓶中，用溶劑加至刻度。計(jì)算公式為：X=A·V/d·1000式中：X——應(yīng)吸取受試物的容積（m1）A——設(shè)計(jì)要求的受試物濃度（mg/m1）V——容量瓶容積（m1）d——受試化學(xué)物比重3.2受試物的配制3.2.1等容量稀釋法：按實(shí)驗(yàn)最大劑量組所需受試物溶液的濃度及體積，計(jì)算所需受試物量，配制最高劑量組試液；再按組距，逐組稀釋，分別配出各劑量組所用的受試物藥液。3.2.2等濃度稀釋法：將受試物配成一種濃度的溶液，各劑量組的動(dòng)物將給予不同體積的受試物。等容量稀釋法和等濃度稀釋法計(jì)算舉例如下：若最大劑量組為760mg/kg（7.6mg/10g），灌胃量為0.1ml/10g，則受試物濃度應(yīng)為7.6mg/0.1ml，即76mg/1ml。欲配置50ml該溶液，需受試物量為7.6mg/0.1ml×50ml=3800mg。其余試劑的配制依此類推，詳見(jiàn)表1。表1兩種稀釋法配制受試物計(jì)算結(jié)果舉例劑量（mg/kg）等容量稀釋法等濃度稀釋法濃度（mg/ml）灌胃量（ml/10g）濃度（mg/mL）灌胃量（ml/10g）760760.1760.1380380.1760.2190190.1760.4959.50.1760.849.54.950.1761.64.灌胃染毒及毒效觀察4.1要求灌胃染毒應(yīng)在動(dòng)物空腹時(shí)進(jìn)行，一般在染毒前禁食4小時(shí)。因?yàn)槲竷?nèi)充滿食物會(huì)增加注入阻力，并影響毒物的吸收。4.2灌胃量本實(shí)驗(yàn)各劑量組采用等容量灌胃法，灌胃量為0.1ml/10g。若小鼠體重為18g，則灌胃量為0.18ml。4.3灌胃操作左手抓住小鼠耳后、頸部的皮膚，用無(wú)名指、小指和大魚際肌將其尾根部壓緊，將動(dòng)物固定成垂直體位，腹部面向操作者，注意使動(dòng)物的上消化道固定成一直線。右手持灌胃針，吸取所需受試物溶液后，將針頭由小鼠口腔插入，避開牙齒，沿咽后壁緩緩滑入食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺(jué)阻力消失，即可將灌胃針插入胃部。如遇動(dòng)物掙扎抵抗，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬(wàn)不可強(qiáng)行插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物立即死亡。小鼠的進(jìn)針深度一般為2.5-4cm。為驗(yàn)明是否已正確地插入胃部，可輕輕抽回注射器，如無(wú)氣泡抽出，表明以插入胃中；如有大量氣泡，則提示誤入氣管，應(yīng)抽出重插。確定將灌胃針插入胃部后，將受試物溶液注入小鼠胃部并抽出灌胃針，完成灌胃操作。一般小鼠的灌胃容量為0.2-1ml。4.4毒效應(yīng)觀察染毒后注意觀察并記錄動(dòng)物毒性體征和死亡情況。高劑量組動(dòng)物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應(yīng)立刻密切注視。觀察內(nèi)容包括：①動(dòng)物的死亡時(shí)間，各組動(dòng)物的死亡數(shù)；②中毒癥狀，各組動(dòng)物出現(xiàn)癥狀時(shí)間、表現(xiàn)等。持續(xù)觀察，直到動(dòng)物不再因藥物作用而死亡為止。觀察期間應(yīng)注意保證食、水、溫度等生活條件，嚴(yán)防非試驗(yàn)因素引起的死亡。最后將死亡情況及各種數(shù)據(jù)填入實(shí)驗(yàn)報(bào)告中。5.計(jì)算LD50按改良寇氏法公式進(jìn)行計(jì)算。LD50=log-1[Xm-i（∑P-0.5）]（公式1）Xm：最大劑量組劑量對(duì)數(shù)值i：相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對(duì)數(shù)(相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值)P：各組動(dòng)物死亡率，用小數(shù)表示（如果死亡率為80%應(yīng)寫成0.80）∑P：各組動(dòng)物死亡率之總和