植物細胞工程的理論基礎第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五§1.細胞分化和全能性一.細胞全能性的一般概念二.細胞分化三.離體培養(yǎng)中細胞的脫分化、再分化第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五一.細胞全能性的一般概念

一個細胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力稱之為細胞的全能性。

細胞全能性的絕對性與相對性:

不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應;即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體;動、植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細胞類型不同從強到弱:營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細胞>厚壁細胞(木質化細胞)>特化細胞(篩管、導管細胞)；根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導組織>厚壁組織。第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五二.離體培養(yǎng)中細胞的脫分化（Dedifferentiation）

脫分化

外植體―→愈傷組織或↗體細胞胚↘完整植株

脫分化細胞↘不定器官↗

直接伸長

莖尖培養(yǎng)（較大時）――→完整植株

發(fā)育

幼胚培養(yǎng)（較大時）――→完整植株第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五外植體：植物組織培養(yǎng)中用來進行無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質體等。第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五脫分化后的細胞，經(jīng)過細胞分裂，產(chǎn)生無組織結構、無明顯極性的、松散的細胞團稱為愈傷組織。

愈傷組織的種類

1、胚性愈傷組織（Embryoneniccallus）：表面光滑、組織結構緊湊、細胞小、再生力強。

胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。

2、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結構疏松、細胞大。

第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五非胚性愈傷組織胚性愈傷組織第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五注意：

1、并不是所有的細胞脫分化的結果都必然形成愈傷組織。有些植物體的細胞脫分化以后直接形成胚性細胞，進而形成體細胞胚。

2、多數(shù)愈傷組織內的細胞并不都是未分化的細胞，即同一愈傷組織內的細胞之間其狀態(tài)存在一定的差異。第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五三.細胞分化細胞分化，是指導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。分化也可以說是相同基因型的細胞所具有的各個不同的表現(xiàn)型。時間上的分化：一個細胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)結構和功能；空間上的分化：對于多細胞生物來講，同一細胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)結構和功能第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五1．細胞分化與基因組變化

細胞分化過程中，可以觀察到的最常見的變化是染色體的反復復制，而并不進行細胞分裂。核內染色體的復制過程可以區(qū)分出兩種主要類型：一是核內有絲分裂，導致核內多倍體，二是大量復制染色絲，導致形成多線染色體。另一類基因組的變化是基因重排。例如，在玉米、金魚草等植物中，轉座子的移動能引起很多發(fā)育性狀的改變，第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五2.細胞分化與極性建立

極性是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結構以及生理生化上的梯度差異。在很多情況下，細胞的不均等分裂是是細胞極性建立的標志。無論是在活體還是在離體條件下，目前一般認為，極性的建立和維管成分的產(chǎn)生，是植物細胞分化的基本特征第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五3.細胞分化的過程

細胞分化可分為兩個階段：1.決定：早期在動物發(fā)育研究中使用這一概念，它通常是指胚胎細胞在發(fā)育過程中發(fā)生的不可逆的特化現(xiàn)象。因此，決定就是細胞發(fā)育途徑的確定，它是細胞分化的早期過程；2.分化細胞特征逐漸表現(xiàn)：在大多數(shù)情況下，細胞從決定到表現(xiàn)特定細胞特征通常需要經(jīng)過幾代細胞的傳遞（細胞分裂）。第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五4.影響細胞分化的因素a.激素

生長素能促進維管組織形成細胞分裂素與木質部的發(fā)生有關第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五激素在細胞分化中的作用，可能是通過在轉錄或翻譯水平上的調節(jié)作用而影響相關基因的表達從而調控細胞分化。但植物中細胞種類的不同或同一種細胞不同的發(fā)育狀態(tài)，均會影響該種細胞對激素的反應，即靶細胞反應差異，所以試圖尋找不同激素在分化中作用的共同模式可能是很困難的。第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五b、蔗糖濃度第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五C、光照與溫度

光照對于維管組織的分化具有促進作用，適宜的溫度對于維管組織的分化是必需的。第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五§2.器官發(fā)生一．離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的方式二.器官分化的過程三.影響器官分化的因素第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五植物的離體器官的發(fā)生：培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。

不定根：從莖、葉上生出的根叫做不定根

不定芽：不是從葉腋或枝頂發(fā)出，而是從葉子、根上或從樹干上發(fā)出的芽

第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五一.離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的方式通過器官發(fā)生形成再生植株大體上有三種方式：第一種方式是先芽后根；如小麥，蘆薈、蘋果第二種方式為先根后芽；如枸杞、苜蓿等第三種方式是在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。如胡蘿卜、石刁柏第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五二.器官分化的過程離體條件下，經(jīng)過愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過三個生長階段

1.外植體經(jīng)過誘導形成愈傷組織。

2.生長中心的形成。當把愈傷組織轉移到有利于有序生長的條件下以后，首先在若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細胞群，稱之為生長中心或擬分生組織，它們是愈傷組織形成器官的部位。

3.器官原基及器官形成。生長中心形成后，按照其已確立的極性，某些細胞開始分化形成管狀細胞，進而形成微管組織，開始形成不同的器官原基，進而分化出相應的組織和器官。第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五生長中心（擬分生組織）器官原基芽形成第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷組織即可形成器官原基，有兩種情況，一是外植體中已存在器官原基，進一步培養(yǎng)即形成相應組織器官進而再生植株，另一種情況是外植體形成分生細胞團后在分生細胞團上直接形成器官原基。第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五一般認為，芽和莖原基通常起源于培養(yǎng)組織中比較表層的細胞，即外起源，而根原基則發(fā)生在組織較深處，是內起源。第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五三.影響器官分化的因素1.外植體-位置、狀態(tài)及組織類型（蘆薈、小麥）外植體的狀態(tài)和組織類型影響誘導和分化的難易；外植體的部位直接影響器官分化的類型。例如：蘆薈第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五有變態(tài)器官（如鱗莖、球莖、塊莖等）的植物，在培養(yǎng)中往往也容易形成相應的變態(tài)器官，如百合、水仙等鱗莖類植物培養(yǎng)中往往易形成小鱗莖；馬鈴薯等塊莖植物培養(yǎng)中則可觀察到塊莖的形成。這一特性也使以變態(tài)器官為繁殖體的植物實現(xiàn)實驗室工廠化生產(chǎn)種子提供了可能。第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五2.生長調節(jié)劑

生長調節(jié)劑在細胞生長與個體發(fā)育中具有重要的調控作用。離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)情況下是通過外源提供適宜的植物生長調節(jié)劑來實現(xiàn)的。種類、濃度和不同類型生長調節(jié)劑的比例是影響根芽等分化的關鍵。第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五3.光照光照有利于維管組織和葉綠體形成進而分化芽

愈傷組織的誘導培養(yǎng)一般是在黑暗或弱光照條件下進行的，細胞中完全沒有維管成分，當轉入強光照條件下以后，才能逐漸變綠并形成維管組織。分化培養(yǎng)的初期連續(xù)光照能促進愈傷組織變綠，隨后的晝夜交替則有利于細胞極性的建立，從而促進器官分化。有些植物，只有在一定的光周期條件下才能分化芽，如天竺葵的愈傷組織進入器官分化培養(yǎng)，一般要在16h/d光照和8h/d黑暗條件下才能分化芽。第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五4.溫度

愈傷組織誘導培養(yǎng)時，溫度可以適當提高，而分化溫度比誘導溫度要低。如煙草，愈傷組織生長時33℃仍可良好生長，而分化則必需在18℃條件下才適宜。與光周期相似，某些需要通過低溫春化的植物，在離體培養(yǎng)中器官形成有時也需要低溫處理，特別時對于某些特殊目的的培養(yǎng)，需要考慮這一因素，如菊苣根培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織，誘導分化時經(jīng)低溫處理可形成花芽，而在25℃下培養(yǎng)只能形成營養(yǎng)芽。第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五§3.離體培養(yǎng)下的遺傳與變異一、培養(yǎng)細胞變異的類型二、變異原因三、影響離體培養(yǎng)細胞遺傳變異的因子四、體細胞無性系變異的誘導五、優(yōu)良變異的篩選方法六、體細胞無性系變異的利用七、變異的抑制第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五一、培養(yǎng)細胞變異的類型

離體培養(yǎng)中，組織、細胞、原生質體培養(yǎng)再生植株中，會有各種各樣的變異。例如，葉色、花色的變異，株高、果實大小的變異，染色體結構和數(shù)目的變異，由于離體培養(yǎng)條件下并沒有發(fā)生雌雄配子的重組和交換。由于它們沒有發(fā)生有性過程，因此，我們把在組織培養(yǎng)條件下所表現(xiàn)的遺傳與變異特征稱之為體細胞遺傳與變異，由此發(fā)展起來的遺傳學分枝稱為體細胞遺傳學。第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)細胞變異的類型

1、自發(fā)產(chǎn)生的變異，即培養(yǎng)物在未加誘變因素的情況下產(chǎn)生變異。

2、誘發(fā)產(chǎn)生的變異，即培養(yǎng)物在誘變因素作用下產(chǎn)生變異。

前者變異率一般在10-7~10-6之間，后者一般在10-5~10-4。

第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五1、自發(fā)產(chǎn)生的變異A.染色體多倍性和非整倍性第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五B.畸形變異

最常見的變異是白化苗突變，其次是產(chǎn)生叢生芽、肉質莖芽等。第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五

安祖花第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五C.非遺傳變異a、外遺傳變異（epigeneticvariation)在植物愈傷組織培養(yǎng)過程中，常常出現(xiàn)一種不涉及基因結構的變化，而只是在基因表達水平上的變異，如最常見的生長素自養(yǎng)型變異。這種變異不能通過有性世代傳遞給后代植株，但在離體條件下卻可以經(jīng)過培養(yǎng)繼代，長期保存。（馬鈴薯）第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五b、生理適應（physiologicadaptation）變異

通常是在某種外界條件存在時才表現(xiàn)出變異，外界條件不存在時，變異也隨之消失第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五2、誘發(fā)產(chǎn)生的變異（抗鐮刀菌毒素細胞變異系的分離）

將誘導產(chǎn)生的愈傷組織接種在含不同濃度梯度毒素的培養(yǎng)基上

篩選得到半致死劑量濃度、100%生長抑制生長濃度、致死計量濃度

以半致死劑量為最低濃度，逐代增加毒素濃度至致死劑量濃度

轉移至無毒素培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)兩代

轉移到致死劑量和高于致死劑量的培養(yǎng)基培養(yǎng)，統(tǒng)計存活率第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五二、變異原因：

1、

植物本身的異質性（嵌合性）（不是真正意義上的突變）

無性繁殖植物的體細胞中，存在廣泛的異質性（如體細胞突變等原因造成），在整體中被掩蓋，無法表現(xiàn)出來。在離體培養(yǎng)中，原來具有不同類型的細胞被誘導分裂，由這些變異的細胞再生的植株為變異植株，經(jīng)過一定的選擇，選育新品種。

第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五2、培養(yǎng)條件引起的變異

變異原因可能與如下因素有關：

1）

培養(yǎng)基中添加的激素

2）

形成愈傷組織過程中，細胞分裂異常

3）環(huán)境條件的改變（溫度、光照時間及強度與原來生長環(huán)境不同）第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五三.影響離體培養(yǎng)細胞遺傳變異的因子1、供體植株

倍性水平、基因型、外植體細胞的分化程度

2、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式

培養(yǎng)基的成分、物理狀態(tài)及培養(yǎng)類型

原生質體培養(yǎng)的體細胞變異大于細胞培養(yǎng)的變異，而細胞培養(yǎng)的變異又大于組織器官培養(yǎng)的變異

3、繼代培養(yǎng)的次數(shù)

一般來講，繼代時間越長、繼代次數(shù)越多，細胞變異的幾率越大。第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五四.體細胞無性系變異的誘導

自發(fā)變異往往頻率較低，為了增加變異頻率，在培養(yǎng)基中添加化學誘變劑或使用物理方法處理，這樣，細胞群體中就會產(chǎn)生各種各樣的變異第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五誘變劑類型：

誘變劑包括物理的和化學的兩大類。

物理誘變劑：X射線、γ射線、中子、β粒子、α粒子和紫外線等。

化學誘變劑：烷化劑、堿基類似物、移碼誘變劑和某些抗生素類等。

作用機理各不相同。第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五五、優(yōu)良變異的篩選方法

1、離體條件下體細胞無性系變異的篩選的優(yōu)點：

（1）可以在小空間內對大量個體進行選擇

（2）不受季節(jié)限制，篩選效率高

（3）誘變和篩選條件可以根據(jù)需要進行調節(jié)和控制，提高了試驗的重復性。

（4）理化誘變劑可較均勻接觸細胞，因此可以引起培養(yǎng)細胞較高頻率發(fā)生突變，增加了選擇機會

（5）變異是在單細胞水平上進行的，避免了整株水平上常呈現(xiàn)出的嵌合體，可以省去變異分離的麻煩。第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五2、體細胞變異材料的選擇

選擇起始材料需根據(jù)試驗目標確定，一般應考慮（1）目標性狀的可行性。體細胞突變的頻率雖然較高，但對于某一個體來講，變異的性狀是個別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個別不良性狀，是體細胞突變系選擇的目的。

（2）必須充分考慮試驗植物的細胞培養(yǎng)技術水平，只有對起始材料有良好的培養(yǎng)技術，才有可能制定完滿的誘變及選擇方案。如果起始細胞的培養(yǎng)技術不成熟，不能再生植株，則不能進行后繼的各項操作。

第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五（3）適當?shù)募毎愋鸵彩翘岣唧w細胞突變系篩選效率的重要條件。

雖然各種狀態(tài)下的培養(yǎng)細胞均可以作為分離突變細胞的來源，但實踐中原生質體和懸浮細胞系被優(yōu)先考慮第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五3、篩選方法

（1）直接篩選法

在設計的選擇條件下，能使培養(yǎng)細胞或再生個體獲得直接感官上的差異，因此能將突變個體和非突變個體分離。最直接的做法是用一種含有特定物質的選擇培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基上只有突變細胞能夠生長，而非突變細胞不能生長，從而直接篩選出突變體，如抗除草劑、抗鹽突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質

。

另外也可以在再生植株水平上進行篩選。第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五A培養(yǎng)及篩選過程（在細胞水平上）：

組織、器官、愈傷組織、原生質體等

↓誘發(fā)變異處理、篩選壓

耐性愈傷組織

↓

再生植株

↓鑒定

耐性植株

第54頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五B培養(yǎng)及篩選過程（在再生植株水平上）：

組織、器官、愈傷組織、原生質體等

↓誘發(fā)變異處理

愈傷組織

↓

再生植株

↓篩選壓

耐性植株

第55頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五第56頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五2、間接篩選法

間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)型有關的性狀作為選擇指標的篩選方法。當缺乏直接選擇表型指標或直接選擇條件對細胞生長不利時，可考慮采用間接篩選法。

抗病突變體的篩選也常常用間接篩選的策略。由于在離體培養(yǎng)中直接接種病原物會嚴重阻礙細胞生長，因此可以在培養(yǎng)基中加入一定劑量的病原物類毒素來增加選擇壓力。第57頁，共62頁，2023年，2月20日，星期五體細胞無性系變異的表示方法：

（1）Chaleff提出的以R0、R1、R2、….分別代表體細胞無性系變異的當代和自交以后的世代

（2）Larkin和Scowcroft提出的SC1、RC2、RC3…..分別代表當代和自交以后的世代第58頁，共62頁，2