第五章代謝物酶法分析技術(shù)江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院姜旭淦全國(guó)高等醫(yī)藥院校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)規(guī)劃教材臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)

（第二版）代謝物酶法分析技術(shù)：用酶法分析的方法來(lái)測(cè)定體內(nèi)的代謝物或代謝產(chǎn)物的技術(shù)。酶法分析（Enzymaticmethod）：以酶為試劑測(cè)定酶促反應(yīng)的底物、輔酶（輔基）、激活劑或抑制劑，以及利用酶促反應(yīng)測(cè)定酶活性的一類方法。概念2目錄

代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)1代謝物酶法分析的方法

2代謝物酶法分析的設(shè)計(jì)要求

33第一節(jié)代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)

代謝物酶法分析

平衡法（終點(diǎn)法）

速率法（動(dòng)力學(xué)法）

4平衡法：標(biāo)本中待測(cè)物的量有限，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)逐漸被消耗，當(dāng)剩余的底物量很小（<1%～5%）時(shí)，指示反應(yīng)信號(hào)逐漸達(dá)到平衡，即通常所說(shuō)的終點(diǎn)，所以又稱為終點(diǎn)法(end-pointmethod)。平衡法的特點(diǎn)是測(cè)定待測(cè)物的總變化量，即測(cè)定的是“濃度”。一、平衡法基本理論5積分得：

米氏方程

改寫(xiě)為

若反應(yīng)達(dá)到平衡，假設(shè)，即[S0]－[St]≈[S0]，

則可簡(jiǎn)化為：達(dá)到平衡所需的時(shí)間與Km、Vmax、[S0]有關(guān)，Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越?。ù郎y(cè)物越少）則達(dá)到平衡所需的時(shí)間越短。6若[S0]<<Km

積分得：

可簡(jiǎn)化為：

若同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)管，不管反應(yīng)到達(dá)何種程度，只要標(biāo)準(zhǔn)管與測(cè)定管反應(yīng)時(shí)間（t）一致，則有：7

標(biāo)準(zhǔn)管的[S0－St]與待測(cè)管的[S0－St]分別代表消耗量，也代表轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，可以用產(chǎn)物的吸光度來(lái)表示（As和Au）。標(biāo)準(zhǔn)管的[S0]與測(cè)定管的[S0]分別表示為Cs和Cu。當(dāng)[S0]－[St]≈[S0]，即反應(yīng)基本達(dá)到平衡，Au和As基本穩(wěn)定不變，此時(shí)測(cè)定誤差最小。如果存在基質(zhì)效應(yīng)，兩者反應(yīng)程度不一，若按上式計(jì)算就會(huì)帶來(lái)誤差。8速率法(rateassay)又稱動(dòng)力學(xué)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法，測(cè)定的是速率（通常指的是初速度）。依據(jù)：當(dāng)?shù)孜锏南牧枯^小時(shí)(<5%)，酶促反應(yīng)呈一級(jí)反應(yīng)，此時(shí)的反應(yīng)速度（v）與代測(cè)物的濃度成正比例。速率法的關(guān)鍵是如何使酶促反應(yīng)成一級(jí)反應(yīng)。

速率法基本理論二、9根據(jù)米氏方程：

①當(dāng)[S]<<Km，則[S]+Km≈Km②當(dāng)酶量固定不變時(shí)，酶促反應(yīng)的最大速度Vmax也不變符合一級(jí)酶促反應(yīng)米氏方程改為：

10若同時(shí)帶標(biāo)準(zhǔn)管，則有：標(biāo)準(zhǔn)管的[S0]與測(cè)定管的[S0]分別表示為Cs和Cu，速度用△A/min來(lái)表示。上式改寫(xiě)為：速率法測(cè)定代謝物濃度的原理

在臨床操作中，只要測(cè)定期間待測(cè)物消耗<5%，測(cè)定兩個(gè)固定時(shí)間的吸光度差值，就可以采用標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)照法計(jì)算樣本濃度。11酶作用的特異性高，血清等體液樣品不需預(yù)處理就能測(cè)定，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序；試劑酶大多是蛋白質(zhì)，沒(méi)有毒性，避免了化學(xué)品對(duì)環(huán)境的污染；酶促反應(yīng)溫和，制成試劑盒可適用于自動(dòng)分析。

代謝物酶法分析主要優(yōu)點(diǎn)：代謝物酶法分析在準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度和線性測(cè)定范圍等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)的化學(xué)法。代謝物酶法分析的方法

第二節(jié)12直接法：待測(cè)物與產(chǎn)物在理化性質(zhì)上有便于檢測(cè)的信號(hào)，可直接測(cè)定待測(cè)物或產(chǎn)物本身信號(hào)的改變來(lái)進(jìn)行定量分析的方法。單酶反應(yīng)直接法一、13（一）單底物反應(yīng)直接測(cè)定法

尿酸+O2+H2O尿囊素+CO2+H2O2膽綠素+H2O膽紅素+O2

尿酸在293nm

處有吸收，而尿囊素沒(méi)有吸收，在293nm

處測(cè)定吸光度下降來(lái)對(duì)其定量。膽紅素在450nm處有吸收，而膽綠素沒(méi)有吸收，在450nm處測(cè)定吸光度下降。尿酸紫外法測(cè)定膽紅素測(cè)定14膽紅素氧化酶法

膽紅素呈黃色，在450nm處有最大吸收峰，膽紅素氧化酶催化膽紅素氧化形成膽綠素，隨著膽紅素被氧化，膽紅素在450nm處吸光度下降，下降程度與膽紅素被氧化的量相關(guān)。在pH為8.0的條件下，未結(jié)合膽紅素及結(jié)合膽紅素均被氧化，因而檢測(cè)450nm吸光度的下降值反映的是總膽紅素的含量。15（二）雙底物反應(yīng)直接測(cè)定法

對(duì)于雙底物反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)一般將所加的另一種底物濃度設(shè)計(jì)得相當(dāng)大，即[S2]>>Km2，這時(shí)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可按單底物法處理，整個(gè)反應(yīng)只與待測(cè)物有關(guān)，呈一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。以NADH或NADPH為底物的終點(diǎn)法測(cè)定中，因340nm吸光度的限制，輔酶的用量不可能過(guò)高。

16第17頁(yè)脫氫酶法測(cè)定乳酸根據(jù)乳酸在乳酸脫氫酶（LD）催化下脫氫生成丙酮酸，氧化型NAD+接受氫轉(zhuǎn)變成還原型NADH。加入硫酸肼可捕獲產(chǎn)物丙酮酸促成反應(yīng)完成。生成的NADH與乳酸為等量摩爾，于340nm波長(zhǎng)測(cè)定NADH的吸光度，可計(jì)算出血液中的乳酸含量。17第18頁(yè)脫氫酶法測(cè)定丙酮酸是乳酸測(cè)定的逆反應(yīng)，丙酮酸在LD的催化下，接受NADH遞給的氫，還原為乳酸并生成NAD+。根據(jù)NADH吸光度的下降值可測(cè)定樣品中的丙酮酸。18第19頁(yè)脫氫酶法測(cè)定血漿β–羥丁酸β-羥丁酸在β-羥丁酸脫氫酶的催化下，被氧化生成乙酰乙酸，同時(shí)NAD+被還原為NADH，在pH8.5時(shí)測(cè)定340nm波長(zhǎng)下NADH吸光度上升的速率，就可以計(jì)算出血漿中β-羥丁酸的濃度。19酶偶聯(lián)法：酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物沒(méi)有可直接檢測(cè)的成分，將反應(yīng)某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個(gè)酶促反應(yīng)中，從而達(dá)到檢測(cè)目的的方法。最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個(gè)：一個(gè)是脫氫酶指示系統(tǒng)，另一個(gè)為過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)。

酶偶聯(lián)法二、20（一）脫氫酶指示系統(tǒng)

輔酶Ⅰ(NAD+)

或氧化型輔酶Ⅱ(NADP+)變?yōu)檫€原型NAD(P)H后，在340nm

處的吸光度增高來(lái)計(jì)算出被測(cè)物的濃度。NAD(P)H變?yōu)檠趸蚇AD(P)+，測(cè)定340nm

處吸光度的下降來(lái)計(jì)算被測(cè)物的濃度。21脫氫酶指示系統(tǒng)

血清葡萄糖己糖激酶法測(cè)定

Glu+ATPG-6-P+ADPG-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反應(yīng)將NADP+轉(zhuǎn)化為NADPH+H+，測(cè)定340nm吸光度上升的速度與葡萄糖的含量成正比

22脫氫酶指示系統(tǒng)

血清尿素測(cè)定

尿素+H2O2NH3+CO2NH3+α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸+H2O+NAD+測(cè)定340nm吸光度下降的速度與尿素的含量成正比，可以用速率法測(cè)定；也可以用平衡法測(cè)定。23但該法存在內(nèi)源性氨和外源性氨，以及內(nèi)源性脫氫酶和還原型輔酶的干擾，需采用含LD抑制劑（如高濃度丙酮酸）的雙試劑法來(lái)測(cè)定，否則測(cè)定結(jié)果偏高。第24頁(yè)酶偶聯(lián)脫氫酶法測(cè)定尿素方法性能評(píng)價(jià)尿素酶偶聯(lián)脫氫酶法測(cè)定血清尿素方法簡(jiǎn)便、快速，適用于臨床常規(guī)分析24第25頁(yè)脫氫酶法測(cè)定肌酐肌酐在肌酐亞氨基水解酶(CRDI)的作用下水解為N-甲基-乙內(nèi)酰脲和NH4+，NH4+與NADPH和α-酮戊二酸在GLDH的作用下，生成L-谷氨酸和NADP+，記錄340nm處吸光度的下降，進(jìn)而計(jì)算出標(biāo)本中肌酐的濃度。25第26頁(yè)②該方法的主要缺點(diǎn)是試劑不夠穩(wěn)定，且肌酐酶來(lái)源困難，使得試劑盒價(jià)格昂貴，影響其在臨床實(shí)驗(yàn)室的普遍使用。①肌酐脫氫酶法與參考方法高效液相色譜法具有良好的相關(guān)性，精密度好、準(zhǔn)確度高、線性范圍寬，不受黃疸、乳糜血、溶血和臨床常用治療藥物及體內(nèi)代謝物的干擾，結(jié)果更趨于真值，易于自動(dòng)化分析，可用于血液及尿液的檢測(cè)。肌酐脫氫酶法性能評(píng)價(jià)③相比之下，肌氨酸氧化酶法具有靈敏度高，線性范圍寬，試劑穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。26第27頁(yè)酶法測(cè)定血漿碳酸氫根血漿中的HCO3-在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化下，與磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反應(yīng)，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸和蘋果酸脫氫酶（MDH）反應(yīng)，生成蘋果酸，同時(shí)將NADH氧化成NAD+；在340nm波長(zhǎng)處吸光度的降低與樣品中HCO3-含量成正比。27（二）過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)

共用的指示反應(yīng)最早由Trinder等人提出，被稱為Trinder反應(yīng)。廣泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、膽固醇、甘油三酯等項(xiàng)目的測(cè)定28化學(xué)名英文縮寫(xiě)最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N-乙基-N-（2-羥基-3-丙磺酰）間甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)

常用的Trinder反應(yīng)生色基團(tuán)

29第30頁(yè)1.葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖根據(jù)GOD可以高特異性的催化葡萄糖氧化成為葡萄糖酸并同時(shí)產(chǎn)生H2O2，生成的H2O2參與Trinder反應(yīng)，生成醌亞胺色素，在505nm波長(zhǎng)下比色檢測(cè)，生成的吸光度與葡萄糖濃度成正比。30第31頁(yè)2.酮胺氧化酶法測(cè)定糖化血清蛋白GSP在蛋白酶K的作用下可形成糖化蛋白片段，該片段在KAO的作用下分解為氨基酸、葡萄糖和H2O2，生成的H2O2即可用Trinder反應(yīng)測(cè)定。31第32頁(yè)3.甘油磷酸氧化酶法測(cè)定血清三酰甘油血清TG可被LPL水解為甘油和脂肪酸，生成的甘油被甘油激酶（GK）及ATP磷酸化后形成3-磷酸甘油，磷酸甘油氧化酶（GPO）氧化3-磷酸甘油產(chǎn)生H2O2，生成的H2O2參與Trinder反應(yīng)而被測(cè)定。324.血清總膽固醇氧化酶測(cè)定法

膽固醇酯+H2O膽固醇+O2膽固醇+脂肪酸△4-膽甾烯酮+H2O2紅色醌類化合物H2O2+4-AAP+

酚指示酶反應(yīng)生成的紅色醌類化合物可在500nm處比色測(cè)定33第34頁(yè)5.勻相法測(cè)定HDL-C利用一系列反應(yīng)先將CM、VLDL、LDL或其反應(yīng)產(chǎn)物清除，然后加入一種特殊的選擇性表面活性劑，使HDL顆粒形成可溶狀態(tài)，其釋放的膽固醇和膽固醇酯與CEH及COD反應(yīng)，生成的H2O2用Trinder反應(yīng)測(cè)定。34利用底物和輔酶的反復(fù)反應(yīng)，使待測(cè)物的酶促反應(yīng)產(chǎn)物不斷擴(kuò)增。

當(dāng)待測(cè)物濃度很低時(shí)，指示反應(yīng)可檢測(cè)信號(hào)很小。利用酶促反應(yīng)，使待測(cè)物和終產(chǎn)物之間的部分反應(yīng)能循環(huán)進(jìn)行，使檢測(cè)信號(hào)不斷增加。。。。。

酶循環(huán)法三、35使用兩種酶，一種氧化酶用于靶物質(zhì)的氧化，一種脫氫酶使其回到還原狀態(tài)，促使靶物質(zhì)（或其衍生物）或靶物質(zhì)的氧化產(chǎn)物作為底物循環(huán)。（一）產(chǎn)物循環(huán)----氧化酶－脫氫酶系統(tǒng)

ABCEaEaEi36產(chǎn)物循環(huán)-------氧化酶－脫氫酶系統(tǒng)

甘油濃度測(cè)定

檢測(cè)指示系統(tǒng)：①循環(huán)前、后用速率法測(cè)定NADH(340nm)的變化。②檢測(cè)產(chǎn)物H2O2可通過(guò)Trinder

反應(yīng)比色測(cè)定。37（二）底物循環(huán)ABCEa1Ea2EiABEiEa(i)DEa3ABCEa1Ei38（二）底物循環(huán)

1.脫氫酶－輔酶系統(tǒng)用一種脫氫酶和兩種輔酶（thio-NAD+

和NADH）。用395nm～415nm波長(zhǎng)測(cè)定反應(yīng)中氧化型thio-NAD+

轉(zhuǎn)為還原型thio-NADH的增加速度。39血淸膽汁酸測(cè)定

膽汁酸與3-酮類固醇之間構(gòu)成循環(huán)，不斷產(chǎn)生硫代還原型輔酶Ⅰ（黃色），控制好條件，反應(yīng)速度與代測(cè)物膽汁酸呈正比。靈敏度可增加數(shù)十倍。

402.轉(zhuǎn)移酶-水解酶系統(tǒng)

——同型半胱氨酸酶法測(cè)定腺苷S-腺苷同型半胱氨酸次黃苷413.合成酶－脫氫酶系統(tǒng)

-----------氨的測(cè)定NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脫氨-NAD轉(zhuǎn)化為NAD+，經(jīng)亮氨酸脫氫酶將亮氨酸轉(zhuǎn)化為氧化異己酸和NH4+同時(shí)生成NADH，生成的NH4+進(jìn)入循環(huán)再次生成NADH，在340nm測(cè)定。

42很多酶必需某些無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶存在才發(fā)揮其催化活性。脫去酶中關(guān)鍵的無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶之后，酶即失去或降低其催化活性。無(wú)活性或低活性的酶與標(biāo)本混合，標(biāo)本中的無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶使該酶復(fù)活或激活，復(fù)活或激活的比例可反映這些無(wú)機(jī)離子、微量元素或輔酶的含量。激活劑和抑制劑法四、根據(jù)有抑制劑存在時(shí)，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變來(lái)測(cè)定抑制劑的含量。43激活劑與酶結(jié)合后恢復(fù)酶的催化活性44抑制劑與酶結(jié)合后抑制酶的催化活性45第46頁(yè)無(wú)機(jī)離子測(cè)定：（一）丙酮酸激酶法測(cè)定鉀離子（二）β-半乳糖苷酶法測(cè)定鈉離子（三）淀粉酶法測(cè)定氯離子（四）異檸檬酸脫氫酶法測(cè)定鎂離子1酶激活和酶抑制測(cè)定法微量元素測(cè)定：（一）超氧化物歧化酶法測(cè)定銅離子（二）碳酸酐酶法測(cè)定鋅離子有機(jī)磷測(cè)定461.異檸檬酸脫氫酶法測(cè)定血清鎂離子

異檸檬酸+NADP+α-酮成二酸+CO2+NADPH+H+用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA)抑制鈣離子，標(biāo)本中Mg2+通過(guò)恢復(fù)ICD活性，催化異檸檬酸脫氫的正向反應(yīng)，使NADP+還原。

472.葡萄糖激酶法測(cè)定血清鎂

483.Na+的酶法測(cè)定Na+

激活β-半乳糖苷酶水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），產(chǎn)生在420nm波長(zhǎng)有特征吸收光譜的產(chǎn)物鄰-硝基酚。鄰-硝基酚產(chǎn)生的速率與Na+離子濃度呈正比。494.丙酮酸激酶法測(cè)定血清鉀

反應(yīng)中NADH的消耗量與血清中鉀離子濃度呈正比。通過(guò)在340nm處監(jiān)測(cè)吸光度下降速率，即可以計(jì)算鉀離子含量。505.氯離子測(cè)定51第52頁(yè)第52頁(yè)第52頁(yè)第52頁(yè)第52頁(yè)6.超氧化物歧化酶法測(cè)定銅離子黃嘌呤（xanthine）在黃嘌呤氧化酶（XO）的作用下可以生成O2-，該物質(zhì)可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲臜，后者在560nm處有強(qiáng)吸收，而SOD可清除O2-，從而抑制了甲臜（NBTFormazan）的形成。反應(yīng)液的顏色（藍(lán)色）越深，說(shuō)明SOD活性愈低，間接的反映血清中Cu2+離子的濃度，吸光度與濃度成反比。52第53頁(yè)第53頁(yè)第53頁(yè)第53頁(yè)第53頁(yè)第53頁(yè)7.碳酸酐酶法測(cè)定鋅離子將標(biāo)本加入試劑中，標(biāo)本中的鋅即與無(wú)活性的碳酸酐酶結(jié)合，形成有活性的碳酸酐酶，催化醋酸對(duì)硝基酚生成黃色的對(duì)硝基酚，在405nm附近有吸收峰。在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，生成的對(duì)硝基酚吸光度變化速率大小與鋅濃度成正比。53第54頁(yè)8.酶抑制劑法測(cè)定有機(jī)磷乙酰膽堿酯酶催化底物水解生成乙酸和膽堿，后者與5,5-二硫代-雙-2-硝基苯甲酸反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物5-硫代-2-硝基苯甲酸，它在410nm處有最大吸收，測(cè)定它在單位時(shí)間內(nèi)的生成量，即可測(cè)得乙酰膽堿酶的活性。當(dāng)待物中含有機(jī)磷時(shí)反應(yīng)受到抑制，乙酰膽堿酯酶活性降低，吸光度與有機(jī)磷濃度成反比。54試劑酶質(zhì)量要求試劑酶概念試劑酶特征試劑酶純度酶法設(shè)計(jì)要求

酶法設(shè)計(jì)共性要求平衡法設(shè)計(jì)的要求速率法設(shè)計(jì)的要求代謝物酶法分析的設(shè)計(jì)要求

第三節(jié)試劑酶來(lái)源55試劑酶：作為診斷試劑來(lái)測(cè)定化合物濃度或酶活性的一類酶。試劑酶的質(zhì)量要求一、（一）試劑酶的概念56主要來(lái)自動(dòng)植物組織提取及微生物發(fā)酵工程?；蛑亟M酶蛋白也有應(yīng)用。不同來(lái)源的同一種試劑酶有不同的理化特征。必須掌握專一性和分子量、等電點(diǎn)、Km、最適pH，最適溫度等，并熟悉輔助因子、激活劑和抑制劑對(duì)酶活性的影響。

（二）試劑酶的來(lái)源和理化特征57不同的酶試劑系統(tǒng)對(duì)試劑酶的純度有不同的要求。以NAD（P）H為指示反應(yīng)中，要求試劑酶有較高的純度。而在Trinder反應(yīng)中要求相對(duì)低一些。

純度主要指標(biāo)：①酶的比活性，酶的比活性越高，酶的純度越高。②雜酶含量。