文獻(xiàn)綜述堆肥中微生物菌劑篩選研究第1頁/共30頁堆肥中微生物菌劑的篩選研究進(jìn)展第2頁/共30頁一、研究背景二、研究現(xiàn)狀三、研究目的四、存在問題五、研究展望六、研究方案第3頁/共30頁研究背景隨著人類社會的發(fā)展、科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,人們越來越認(rèn)識到資源和環(huán)境對人類的重要性。有機(jī)固體廢物潛在的利用價值也開始為人們所認(rèn)識,這不僅在于其蘊藏著大量的能源物質(zhì)(C素),也在于其擁有豐富的作物所需營養(yǎng)物質(zhì)(N、P、K和微量元素)。堆肥化過程是地球表面生態(tài)過程的一部分,地球表面殘留的枯枝落葉、雜草、樹皮和其他半固體的有機(jī)物不斷分解后再進(jìn)一步參與到物質(zhì)和能量的循環(huán)中[1]。[1]李國學(xué),張福鎖.固體廢物堆肥化與有機(jī)復(fù)混肥生產(chǎn).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.75~97第4頁/共30頁研究背景現(xiàn)代的堆肥化就是在人工控制下,在一定的水分、C/N比和通風(fēng)條件下,通過微生物的發(fā)酵作用,將有機(jī)固體廢物(包括農(nóng)業(yè)廢物、污泥和城市生活垃圾等)轉(zhuǎn)變?yōu)楦迟|(zhì)含量豐富、對環(huán)境不構(gòu)成危害的有機(jī)肥料的生物化學(xué)處理過程[2]。堆肥被認(rèn)為是處理有機(jī)固體廢物實現(xiàn)資源化、無害化的有效方法，成為近年來的研究熱點[3]。[2]ZhuN,DengC,XiongY,etal.Performancecharacteristicsofthreeaerationsystemsintheswinemanurecomposting[J].BioresourceTechnology,2004,95(3):319-326.[3]郭亮.豬場廢棄物強(qiáng)制通風(fēng)靜態(tài)垛堆肥系統(tǒng)的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2002:5-8.第5頁/共30頁研究背景堆肥的實質(zhì)是微生物在適宜條件下的代謝作用，堆體的腐熟速度和固體廢物的降解程度都與堆體內(nèi)的微生物直接相關(guān)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對堆肥中的微生物生態(tài)進(jìn)行了一系列理論和實踐的研究。堆肥中存在著非常復(fù)雜的微生物區(qū)系，在整個堆肥過程中微生物也存在非常大的變化和演替過程[4]。堆肥中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替是個非常復(fù)雜的過程,利用接種微生物菌劑使堆肥物料資源化、無害化己經(jīng)是現(xiàn)階段發(fā)展的趨勢[5]。[4]朱能武.堆肥微生物學(xué)研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J].氨基酸和生物資源,2005,27(4):36-40.

[5]曾光明，黃國和，袁興中等.堆肥環(huán)境生物與控制.北京:科學(xué)出版社，2006.第6頁/共30頁研究現(xiàn)狀微生物在堆肥中的應(yīng)用微生物菌劑的組成復(fù)合微生物菌劑纖維素降解菌的篩選變性梯度凝膠電泳在堆肥微生物研究中的應(yīng)用16S/18SrRNA/DNA序列分析技術(shù)的應(yīng)用第7頁/共30頁微生物在堆肥中的應(yīng)用傳統(tǒng)的堆肥方法存在體積大、發(fā)酵時間長、無害化程度和肥力低等缺點，使其在有機(jī)肥商品化生產(chǎn)中的利用受到明顯限制。目前大規(guī)模的堆肥化過程都會添加一定種類的微生物，利用微生物活動加速物料的發(fā)酵過程，從而從一定程度上克服傳統(tǒng)堆肥方法的缺點[6]。[6]黃丹蓮,曾光明,黃國和,等.微生物接種技術(shù)應(yīng)用于堆肥化中的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2009,25(2)∶60-64.第8頁/共30頁微生物菌劑的組成微生物是堆肥過程的土體。研究表明，單一的細(xì)菌、真菌、放線菌群體，無論其活性有多高，在加快堆肥化進(jìn)程中都比不上多種微生物群體的共同作用。在堆肥中所用的微生物菌劑，是適用于無害化作用的有益微生物優(yōu)良菌株(包括芽抱桿菌、放線菌、乳酸菌、絲狀真菌和光合菌等多種微生物)，應(yīng)用優(yōu)化微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)培養(yǎng)微生物形成的微生物菌劑[7]。[7]曾光明，黃國和，袁興中等.堆肥環(huán)境生物與控制【M】.北京:科學(xué)出版社，2006.第9頁/共30頁復(fù)合微生物菌劑在堆肥體系中,由于菌種之間協(xié)同作用、相互依存和各菌種對環(huán)境的苛刻要求等原因,菌種對易降解和難降解有機(jī)物的分解不是獨立完成的,而是由一定的微生物菌落在起作用。復(fù)合微生物菌群是各種微生物按一定的比例，進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖，菌群結(jié)構(gòu)要合理，存在各菌種的最佳配比，不同環(huán)境條件下，菌種的比例配合不同，所以要得到高效的優(yōu)勢復(fù)合菌，需在最佳混合比方面進(jìn)行深入研究[8-9]。[8]張隴利，劉青，等.復(fù)合微生物菌劑對污泥堆肥的作用效果研究［J］.環(huán)境工程報，2008，2(2):266－269.[9]薛智勇，王衛(wèi)平，朱鳳香，等.復(fù)合菌劑和不同調(diào)理劑對豬糞發(fā)酵溫度及腐熟度的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，17(6):354－358.第10頁/共30頁纖維素降解菌篩選隨著人口的不斷膨脹,農(nóng)業(yè)廢棄物越來越多,包括稻草、谷物秸稈、水稻殼、甘蔗渣、動物糞便,日常生活的廢棄纖維產(chǎn)品,由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶結(jié)構(gòu),外圍又被木質(zhì)素層包圍,而木質(zhì)素的完整堅硬外殼使其水解為可利用的糖類或細(xì)胞蛋白相當(dāng)困難。所以深入研究并充分利用微生物對纖維素的降解作用,加速木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)是堆肥充分腐熟的關(guān)鍵。第11頁/共30頁纖維素降解菌的篩選在堆肥處理中纖維素屬于難降解成分，是限制堆肥速度的因素，許多人都在致力于纖維素分解菌的分離和篩選，來加速纖維素的降解。纖維素的降解與碳素的代謝密切相關(guān)，纖維素在纖維素酶的作用下被分解形成腐殖質(zhì)，釋放碳素養(yǎng)分。但單一菌種很難起到好的降解效果，接種VT菌比空白纖維素酶活性高，有利于堆肥中纖維素的分解[10]。[10]史玉英,沈其榮,婁無忌,等.纖維素分解菌群的分離和篩選.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1996,19(3):59~62第12頁/共30頁纖維素降解菌的篩選纖維素酶(Cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱。至今,已有很多關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌的報道,其中有細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌等，纖維素的微生物降解中一個重要課題就是不斷選育出具有高降解功能的新菌株。纖維素生物降解中,因為細(xì)菌纖維素酶的活性普遍低于真菌,細(xì)菌方面的研究與真菌比相對較少。第13頁/共30頁纖維素降解菌的篩選所以,至今關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌的報道中,對纖維素分解作用較強(qiáng)的菌株多是真菌菌株,而且它們幾乎都是以純培養(yǎng)方法分離和篩選的,對自然結(jié)構(gòu)的纖維素分解能力有限。纖維素的降解是有機(jī)質(zhì)堆肥降解的關(guān)鍵所在,故有學(xué)者用剛果紅透明圈篩選法來篩選研究纖維素高效降解菌[11]。[11]吳元喜,張曉昱,胡佳華,等.木質(zhì)纖維素分解菌篩選及木質(zhì)纖維素降解.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,16(6):614~617。第14頁/共30頁變性梯度凝膠電泳在堆肥微生物研究中的應(yīng)用目前,雖然大多數(shù)研究者仍采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分離和純化堆肥過程中的各種微生物,研究其特性和演替規(guī)律,但一些新的分析方法和技術(shù)也被逐漸采用。如應(yīng)用Biologsystem方法分離、篩選堆肥中屬于專性或兼性嗜熱芽孢桿菌[12],用磷脂脂肪酸方法間接推測微生物的種類和特性[13][12]FangM.,WongJ.W.C.Changesinthermophilicbacteriapopulationanddiversityduringcompostingofcoalflyashandsewagesludge.Wa-ter,AirandSoilPollution,2000,124(3/4):333~343[13]Carpenter-BoggsL.,KennedyA.C.,ReganoldJ.P.Useofphospholipidfattyacidsandcarbonsourceutilizationpatternstotrackmicrobialcommunitysuccessionindevelopingcompost.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1998,64(10):4062~4064第15頁/共30頁變性梯度凝膠電泳在堆肥微生物研究中的應(yīng)用然而這些方法僅限于可以培養(yǎng)的微生物,現(xiàn)代分子生物學(xué)中的變性梯度凝膠電泳分析方法不僅適用于通過普通培養(yǎng)方法得到的微生物,還能夠分離到難以或無法用常規(guī)方法培養(yǎng)的細(xì)菌或厭氧菌,以及混合微生物群落中含量很低的DNA序列,該技術(shù)無需培養(yǎng),不受培養(yǎng)基的影響,非常適用于堆肥這種復(fù)雜環(huán)境中的微生物分析,已引起越來越多研究者的重視變性梯度凝膠電泳(DGGE)是普通凝膠電泳上發(fā)展起來的DNA分離技術(shù)。與普通凝膠電泳相比,DGGE技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和精確度,能夠分離分子大小相同,但堿基順序不同的DNA分子,快速、靈敏,可以直接用于細(xì)菌染色體基因分析[14]。[14]張彤,方漢平.微生物分子生態(tài)技術(shù):16SrRNA/DNA方法.微生物學(xué)通報,2003,30(2):97~101第16頁/共30頁16S/18SrRNA/DNA序列分析技術(shù)的應(yīng)用建立在以16S/18SrRNA/DNA序列分析基礎(chǔ)上的現(xiàn)代分子技術(shù)在不需要培養(yǎng)微生物的條件下，不僅能對分子特性進(jìn)行研究，而且能夠用于數(shù)量檢測和預(yù)測自然進(jìn)化關(guān)系以及物種分類。16S/18SrRNA/DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到各種微生態(tài)研究領(lǐng)域中，如人畜動物胃腸道微生態(tài)、病原菌檢測、石油勘探、垃圾滲濾液、土壤微生物等環(huán)境樣品，在堆肥中的應(yīng)用也大大促進(jìn)了人們對堆肥微生物的全面了解。第17頁/共30頁16S/18SrRNA/DNA序列分析技術(shù)的應(yīng)用隨著核酸數(shù)據(jù)庫的不斷補充和完善16S/18SrRNA/DNA分子標(biāo)記技術(shù)可以實現(xiàn)對復(fù)雜環(huán)境微生物進(jìn)行快速、微量、準(zhǔn)確簡便的分類和檢測，該技術(shù)有三個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：首先要獲得能夠代表實際生境的微生物組成的基因組DNA；其次是構(gòu)建16S/18SrRNA基因文庫，克隆子數(shù)量要足夠多，才能反映環(huán)境樣本實際的微生物組成情況；最后進(jìn)行16S/18SrDNA序列分析。第18頁/共30頁研究目的1.去除堆肥臭味未經(jīng)處理的固體廢物，如垃圾、畜禽糞便等都含有大量的病原菌，易腐爛并產(chǎn)生強(qiáng)烈的惡臭，對環(huán)境有很大的破壞作用。而用自然堆肥的方法處理周期長，在堆制過程中也會產(chǎn)生大量的臭味。經(jīng)研究表明，牛糞中添加特殊微生物菌劑，在通風(fēng)條件培養(yǎng)三天，其糞中的臭味比對照降低了85%一99%[12]。[15]張輝，劉維紅，楊啟銀.幾種微生物在牛糞堆肥中的試驗研究IJI江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，:108一113.第19頁/共30頁研究目的2.縮短堆肥時間傳統(tǒng)堆肥升溫降溫時間長，研究表明，添加微生物菌劑能縮短堆肥時間，并且復(fù)合菌群處理的升溫過程比單一菌群處理要快[13]。[16]劉婷，陳朱蕾，周敬宣.外源接種糞便好氧堆肥的微生物相變化研究華中科技大學(xué)學(xué)報，2002，19(2):57一59.第20頁/共30頁研究目的3.提高堆肥質(zhì)量添加微生物菌劑的堆肥腐殖化程度明顯高于自然堆肥。微生物可以降解一些難分解的物質(zhì)，如纖維素、半纖維素等。并且復(fù)合菌處理降解揮發(fā)有機(jī)物和纖維素的能力明顯強(qiáng)于單一菌種的處理[14]。[17]張輝，劉維紅，楊啟銀.幾種微生物在牛糞堆肥中的試驗研究IJI江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，:108一113.第21頁/共30頁堆肥微生物存在問題目前在微生物學(xué)研究中，傳統(tǒng)的分離純化和培養(yǎng)選育方法仍然是主要的研究方法。然而據(jù)研究報道[15],環(huán)境中存在的大量微生物中可以通過這種傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法獲得的微生物種類僅有l(wèi)%甚至不到l%，而從系統(tǒng)中分離培養(yǎng)得到的微生物物種卻不能真實地反映堆肥中微生物群落的種群組成和變化規(guī)律。由于堆肥中的微生物菌系復(fù)雜,在整個過程中的菌種組成變化較大,用常規(guī)的實驗方法和手段難以完全認(rèn)識,所以極大地限制了對這方面的研究。因此堆肥微生物有效關(guān)鍵菌種的獲得以及作用機(jī)理的揭示在很大程度上依賴于新的研究方法和技術(shù)的出現(xiàn)，也為堆肥工藝的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。[18]AmannRILudwigWSehleiferK.Phylogene:icidentifieationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithouteultivation.Mierobiol.Rv.，(l):143一169第22頁/共30頁研究進(jìn)展運用分子生物學(xué)技術(shù)和手段，對堆肥微生物進(jìn)行分類鑒定。運用現(xiàn)代先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)和研究手段，可直接對堆肥微生物的總DNA進(jìn)行研究，突破了菌株分離和培養(yǎng)的限制，能夠動態(tài)研究微生物群落的多樣性，有助于我們更加深入全面的了解堆肥系統(tǒng)中微生物群落的演替規(guī)律和過程，查明堆肥中起重要作用的微生物種群并能夠?qū)ζ溥M(jìn)行分子鑒定，為推動堆肥理論和技術(shù)的發(fā)展提供生物學(xué)證據(jù)，并可能發(fā)現(xiàn)新的微生物種.第23頁/共30頁研究進(jìn)展采用現(xiàn)代先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)能夠全面了解堆肥微生物的多樣性和分類信息，但是如果能夠結(jié)合分離培養(yǎng)技術(shù)對其進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定以得到更為透徹的了解，各種技術(shù)將在環(huán)境污染檢測和控制以及廢棄物資源化利用方面得到長遠(yuǎn)的發(fā)展。第24頁/共30頁研究進(jìn)展堆肥中存在著大量難以用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的微生物,它們可能是厭氧菌或營養(yǎng)條件苛刻,或者菌種本身是未知的,但是這些菌種可能在堆肥過程中發(fā)揮著重要作用,