第二節(jié)凝膠層析的實(shí)驗(yàn)條件和操作凝膠層析是一種應(yīng)用非常廣泛的純化分離技術(shù)，掌握它的基本原理是為了幫助我們更好地開展實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用，那么如何進(jìn)行凝膠層析的操作呢？下面我們從凝膠的選擇和處理、凝膠層析柱的設(shè)計(jì)和制備、凝膠層析操作、主要參數(shù)測(cè)算等幾個(gè)方面來介紹一下凝膠層析的實(shí)驗(yàn)條件和操作。首先，我們將進(jìn)行凝膠的選擇和處理。選擇適宜的凝膠，是取得良好分離效果的最根本保證，選取何種凝膠及其型號(hào)，粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍，理化穩(wěn)定性，強(qiáng)度，非特異吸附性質(zhì)等，另一方面，還要注意到分離目的和樣品性質(zhì)。對(duì)于生物樣品來說，主要分為兩種分離形式，一種是將分子量相差懸殊的兩類物質(zhì)分開，稱作類分離或組分離，另一類則是將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以分離，稱作分級(jí)分離或組份分離。為類分離選擇凝膠時(shí)，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量，大于其排阻限，而小分子組的分子量，小于滲入線，也就是說，大分子的分配系數(shù)kd=0，而小分子的kd=1，這樣能取得最好的分離效果。為分級(jí)分離選擇凝膠型號(hào)是，必須使各種物質(zhì)的kd值，盡可能相差大一些。要使組份的分子量，盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。如果樣品中含有三個(gè)組份，最好一個(gè)接近全排阻，另一個(gè)接近全滲入，第3個(gè)為部分滲入，且分子量大于滲入線的三倍，小于排阻限的1/3。若分子量與滲入線接近，則難以與低分子組分分開，若分子量與排阻線比較靠近，則難以與高分子組分分開。選擇凝膠時(shí)，還需要關(guān)注凝膠粒度的大小，這對(duì)分離效果也有重要影響，一般來說，細(xì)粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于出質(zhì)分離，脫鹽等。此外，凝膠顆粒必須均勻，大小不均的凝膠顆粒，會(huì)使分離效果大大降低。將干膠過篩或濕膠浮選，都是使凝膠顆粒趨于粒度均一化的手段。簡(jiǎn)而言之，凝膠粒徑越小，粒度均一化程度越高，柱層析效果越好。選擇好適當(dāng)?shù)哪z后，還需對(duì)凝膠進(jìn)行預(yù)處理。凝膠在使用前必須溶脹，干膠顆粒，充分吸收溶劑介質(zhì)，并達(dá)到平衡，體積不再長(zhǎng)大為止。為節(jié)省時(shí)間，還可使用熱法溶脹，即在水浴中加熱溶脹，這樣還可以起到消毒殺菌，去除顆粒內(nèi)部起泡的作用。完成凝膠的選擇與處理后，將對(duì)層析柱進(jìn)行選擇。層析柱的體積與高徑比，與層析分離效果關(guān)系非常密切。層析柱的長(zhǎng)度與直徑的比值一般稱作柱比。而柱比與層析柱的有效體積的選擇，必須根據(jù)樣品的數(shù)量，性質(zhì)以及分離目的，加以確定。對(duì)于類分離，柱床體積一般為樣品溶液體積的5倍，祝比5~10，對(duì)于分級(jí)分離，柱床體積應(yīng)大于樣品體積25倍以上，最高可達(dá)100倍，柱比在25~100之間。此外，層析柱下端縮口底部需滿足不易阻塞，死腔小兩個(gè)特點(diǎn)。由于凝膠層析中，溶質(zhì)分子與固定相之間沒有作用力，因此樣品組份的分離，完全依賴于它們各自的流速差異，而流速又與裝柱密切相關(guān)，因此，裝柱是層析的重要環(huán)節(jié)。首先，對(duì)層析柱進(jìn)行清洗，檢查柱底的凝膠支持物是否符合不堵不漏，不吸附樣品的要求。常用棉花，玻璃纖維，玻璃珠，垂熔玻璃等。開始裝柱時(shí)，應(yīng)預(yù)留1/5的水或溶劑避免膠粒直接沖擊支持物，凝膠懸液濃度不能過稀或過濃，溫度應(yīng)與室溫平衡，并用水泵減壓排氣，進(jìn)膠后應(yīng)打開柱端閥門，進(jìn)膠過程需連續(xù)，均勻，并在不斷攪拌下，使膠粒均勻沉降，保持層析柱垂直，避免發(fā)生凝膠分層和膠面傾斜。完成裝柱后應(yīng)對(duì)凝膠柱進(jìn)行檢查，觀察是否有凝膠分層，溝流和氣泡現(xiàn)象。如層析柱外觀完整，則可用兩倍以上柱床體積的洗脫液，按正常流速過柱，加液前，在膠面上加蓋網(wǎng)狀支持物，防止加液破壞床面平整。為進(jìn)一步檢查凝膠柱質(zhì)量，通常使用藍(lán)色葡聚糖握住，觀察柱床有無溝流，色帶是否平整。為保證凝膠柱處于良好狀態(tài)，滿足對(duì)分離效果和流速的要求，過柱時(shí)，層析柱進(jìn)口與出口之間形成的操作壓應(yīng)符合允許范圍。樣品上柱是凝膠層析中一步關(guān)鍵操作。由于凝膠層析的稀釋作用，被分離樣品濃度應(yīng)大些為好，但樣品濃度不應(yīng)過大，以免造成粘度增大，分辨率下降。對(duì)蛋白質(zhì)類樣品濃度，以不大于4%為宜。理想的樣品色帶應(yīng)是狹窄且平直的矩形色譜帶，加樣時(shí)，應(yīng)盡量減少樣品的稀釋，即凝膠床面的攪動(dòng)，這一點(diǎn)，在分級(jí)分離時(shí)尤為重要。通常情況下，加樣方式主要有兩種：一是直接將樣品加到層析床表面，保證層析床表面沒有多余液體，檢查層析床表面是否平整，然后將樣品緩慢滴加至層析床表面1cm左右，滴加過程，保證層析床平面不被破壞。若樣品過多，待樣液滲入凝膠床內(nèi)反復(fù)進(jìn)行加樣。添加洗脫劑時(shí)，應(yīng)在床面以上保留三厘米左右的液層高度作為緩沖層。第2種方法，是利用兩種液體比重不同而分層的原理，高比重樣品加入床面低比重的洗脫液之中，樣品緩慢均勻下沉于床表面，打開出口，使樣品滲入層析床。完成樣品加入后，應(yīng)開始進(jìn)行洗脫與收集步驟。為防止柱床體積變化，造成流速降低及重復(fù)性下降，整個(gè)洗脫過程中，應(yīng)始終保持一定的操作壓，洗脫液成分不應(yīng)改變，洗脫時(shí)的流速與操作壓有關(guān)，與凝膠的型號(hào)和粒度也相關(guān)，流速不易過快，且要穩(wěn)定。洗脫液的收集，多采用計(jì)時(shí)或計(jì)滴分部收集器。凝膠柱在合理使用情況下一般無需再生便可多次重復(fù)使用，對(duì)于板結(jié)或被污染的凝膠柱，可以采用反沖，漂洗和酸堿浸泡等方法重生后再重新裝柱。掌握了凝膠層析的原理與操作后，我們可以對(duì)V0、Vi、Kd、Kav進(jìn)行測(cè)算，主要采用重量法和過柱法，但由于重量法中Vg難以計(jì)算，導(dǎo)致算法不夠準(zhǔn)確，因此通常采用過柱法進(jìn)行測(cè)算，對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，選取合適的全滲入和全排阻物質(zhì)，測(cè)得的洗脫體積Ve，即可根據(jù)公式Ve=V0+KdVi計(jì)算出凝膠的V0，Vi；同理，對(duì)已知V0，Vi的凝膠也可以根據(jù)洗脫體積和柱床體積，計(jì)算物質(zhì)的Kd、K