..-....word.zl-質(zhì)粒DNA的提取、定量、酶切與PCR一、試驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并把握用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法；學(xué)習(xí)并把握了解質(zhì)粒酶切鑒定的方法；學(xué)習(xí)并把握紫外吸取檢測(cè)DNA濃度和純度的原理和方法；PCR基因擴(kuò)增的試驗(yàn)原理和操作方法；學(xué)習(xí)并把握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用方法。二、試驗(yàn)原理PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒错?在DNA聚合酶催化下，可以DNA為模板，以特定引物為延長(zhǎng)起點(diǎn)，以dNTP為原料，通過(guò)變性、退火、延長(zhǎng)等步驟，在體外〔緩沖液中〕復(fù)制DNA，使目的DNA按2n方式呈指數(shù)形式擴(kuò)增。PCR一次循環(huán)的具體反響步驟為：變性：加熱反響系統(tǒng)至95℃，使模板DNA在高溫下完全變性，雙鏈解鏈。退火：漸漸降低溶液溫度，使合成引物在低溫〔35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右〕，DNA互補(bǔ)退火形成局部雙鏈。延長(zhǎng)：溶液反響溫度升至中溫72℃，在Taq酶作用下，以dNTPDNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延長(zhǎng)為一條雙鏈。DNA(1).堿裂解法：DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性存在差異：高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均變性；當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)整其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀構(gòu)造，可通過(guò)離心形成沉沉淀去除。(2).離心層析柱：pHDNA，而不吸附溶液中的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)；通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；pH值的洗脫緩沖液將純潔質(zhì)粒DNA3.DNA的定量分析〔紫外分光光度法〕：B.各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸取光譜:DNA260nm280nm的紫外光有特異的吸取峰230nm的紫外光有特異的吸取峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反響DNA的純度；A260/A280=1.8 DNA純潔表示樣品中含蛋白質(zhì)〔芳香族〕或酚類物質(zhì)A260/A280<1.8表示樣品中含蛋白質(zhì)〔芳香族〕或酚類物質(zhì)A260/A280>1.8 含RNA雜質(zhì)，用RNADNA的酶切鑒定：限制性內(nèi)切酶是DNA重組操作過(guò)程中所使用的根本工具。限制性內(nèi)切酶能特異性地與一段被稱為限制酶識(shí)別序列的特別DNA序列結(jié)合，或是與其四周的特異位點(diǎn)結(jié)合，并DNA。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNADNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系).三、材料與方法：〔一〕試驗(yàn)材料：1.PCR儀器：PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、微量加樣槍、滅菌的薄壁離心管材料：菌液【大腸桿菌DH5a菌株(pMD19-T質(zhì)粒,含目的片段-綠色熒光蛋白GFP)】、無(wú)菌去離子水、2×PremixTaq、引物DNA的提取與制備儀器：恒溫培育箱、臺(tái)式離心機(jī)、離心層析柱、Eppendorf管、微量加樣槍、離心管材料：溶液P1〔S1〕、溶液P2(S2〕、溶液P3〔S3〕、去蛋白液PE〔W1〕漂洗液WB〔W2〕EB〔Eluent)、含pMD19-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5αDNA的定量〔紫外分光光度法〕材料：蒸餾水、質(zhì)粒ＤＮＡDNA的酶切鑒定..-儀器：1.5ml的EP管、微量加樣槍材料：無(wú)菌水、10×MBufR、質(zhì)粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)5.瓊脂糖凝膠電泳儀器：凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)材料：電泳指示劑、Gelview、TBE、瓊脂糖、DNAMarker5000、電泳緩沖液〔二〕試驗(yàn)方法1.PCR取0.2mlPCR反響管一只，用微量加樣槍按下述挨次分別參加：滅菌去離子水1μl2(101μl5μlPCR反響管置臺(tái)式離心機(jī)中瞬時(shí)離心將裝有將裝有PCR反響體系的PCR反響管放入PCR儀上進(jìn)展如下操作：①94℃預(yù)變性5分鐘后開(kāi)頭以下循環(huán)②循環(huán)為94℃——3050℃——30秒，72℃——1分鐘。循環(huán)為30次③72℃5分鐘④4℃ 保溫將擴(kuò)增后的基因用微量加樣槍加到電泳儀的凝膠孔中質(zhì)粒DNA的提取與制備11.5mlEppendorf管中..-....word.zl-13000rpm13000rpmx1min，棄上清250μlS1，吹打，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮250μlS24～6次混勻〔不要猛烈振蕩〕，直到溶液變得清亮350μlS36~8次。13000rpm10min，留神取上清液〔500-800μl〕將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液參加吸附柱中，13000rpm3min，棄濾液500μl去蛋白液(W1)，13000rpm1min，棄濾液700μlW2，13000rpm1min，棄濾液；重復(fù)一遍13000rpm1min3min，使殘留乙醇揮發(fā)取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加50μl洗脫緩沖液質(zhì)粒DNA的定量〔紫外分光光度法〕清洗比色皿：用微量加樣槍向比色皿參加適清洗比色皿：用微量加樣槍向比色皿參加適空白比照比色測(cè)定向比色皿參加空白比照比色測(cè)定向比色皿參加98ul蒸餾水，進(jìn)展Blank調(diào)零質(zhì)粒DNA的酶切鑒定在一個(gè)干凈的在一個(gè)干凈的1.5mlEP管中按挨次依次參加下述試劑9.0μl、10×M酶切1.0μl、EcoRI(12U/ul) 1.0μl留神混勻試劑，將留神混勻試劑，將EP管置于恒溫水浴箱中37℃1.5小時(shí)。取質(zhì)粒DNA取質(zhì)粒DNADNA片段和PCRDNA6μlEP管中并做好標(biāo)記EP1μlGelview染料，室溫放置一分鐘30分鐘取出凝膠紫外光下觀看，拍照.-四、結(jié)果與爭(zhēng)論：〔一〕試驗(yàn)現(xiàn)象P1，消滅懸消滅象；P2,溫順混勻，溶液會(huì)變得清亮；P3,有白色絮狀沉淀生成；在紫外檢測(cè)儀條件下，可以觀看到不同的物質(zhì)消滅不同的電泳帶。原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)量次數(shù)質(zhì)粒DNA濃度〔ug/ml〕Ratio比值(A260/A280)11481.4621061.5231151.45平均值1231.47電泳后的圖片. .word.zl-..-....word.zl-〔四〕試驗(yàn)分析Ratio=1.47A260/A280<1.8 說(shuō)明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)〔芳香族〕在圖片中，其他三類 DNA與Maker相比較，可知質(zhì)粒 DNA的分子大小在2500bp-3500bp酶切反響的質(zhì)粒DNA片段分子大小在2800-3000bp和400-500左右的DNA分子大小在400-500bp。根本符合預(yù)期?！菜摹吃囼?yàn)爭(zhēng)論DNADNADNADNA。這三種不同構(gòu)型的分子有不同的遷移率，在一般狀況下，遷移速度最快的為超螺旋型，其次為線性分子，最慢的為開(kāi)環(huán)狀分子，所以條帶從上到下分別為：超螺旋型DNA、線性分子、開(kāi)環(huán)狀分子。,對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果中：A260/A280<1.8的可能緣由為：在質(zhì)粒DNA的提取試驗(yàn)的“取上清液”步驟中吸入沉淀導(dǎo)致引入較多的蛋白雜質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)中因蛋白質(zhì)量較多而難以去除。3.試驗(yàn)中需留意的事項(xiàng)：吸頭。在PCR中，假設(shè)配好的反響液較多沾到管壁上，要將PCR反響管置臺(tái)式離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使反響液集中于管底，然后才將反響管放到基因擴(kuò)增儀上。DNA提取的試驗(yàn)中，參加溶液S2次。在電泳中，Geldview有毒，切勿用手接觸。思考題：I、II、III答：IDNAII：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液IIDNA-SDS+線性DNANa+可中和DN