核酸的分子雜交第1頁(yè)/共41頁(yè)ContentofTable

前言1核酸分子雜交技術(shù)的原理2核酸探針的制備3核酸探針的標(biāo)記4核酸分子雜交技術(shù)5生物芯片技術(shù)第2頁(yè)/共41頁(yè)

前言第3頁(yè)/共41頁(yè)

核酸分子雜交

把親源關(guān)系較近的，不同生物個(gè)體來(lái)源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過(guò)程叫分子雜交。Home第4頁(yè)/共41頁(yè)1核酸分子雜交技術(shù)的原理

有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe),與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進(jìn)行雜交。再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測(cè)出來(lái)，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。

第5頁(yè)/共41頁(yè)

應(yīng)用：(1)檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；(2)用來(lái)揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。Home第6頁(yè)/共41頁(yè)2核酸探針的制備2.1探針（Probe)的概念:

一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。第7頁(yè)/共41頁(yè)2.2探針的制備方法長(zhǎng)度一般以50~300bp為宜。制備方法：

(1)DNA重組技術(shù)

(2)PCR擴(kuò)增

(3)化學(xué)合成第8頁(yè)/共41頁(yè)2.3探針的分類

據(jù)來(lái)源及性質(zhì)不同可分為：

(1)基因組DNA探針

(2)cDNA探針

(3)RNA探針

(4)寡核苷酸探針第9頁(yè)/共41頁(yè)2.4合成寡核苷酸探針注意原則(1)長(zhǎng)度（10-50bp);(2)G:C對(duì)含量40%-60%；(3)探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4)避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。Home第10頁(yè)/共41頁(yè)3核酸探針的標(biāo)記

為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。第11頁(yè)/共41頁(yè)3.1標(biāo)記的種類

同位素：

32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針?lè)峭凰兀荷锼亍⒌馗咝僚潴w、熒光素等作為標(biāo)記物

兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)同位素污染。第12頁(yè)/共41頁(yè)一個(gè)理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足：(1)標(biāo)記前后探針基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;(2)特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；(3)操作簡(jiǎn)單、節(jié)時(shí)；(4)安全、無(wú)環(huán)境污染。第13頁(yè)/共41頁(yè)3.2探針的標(biāo)記方法3.2.1缺口平移法3.2.2隨機(jī)引物標(biāo)記法3.2.3末端標(biāo)記法3.2.4生物素光照標(biāo)記法Home第14頁(yè)/共41頁(yè)缺口平移法的原理

將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相結(jié)合。首先用E.coli的DNAseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時(shí)利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。

這兩種活性同時(shí)作用，缺口不斷向3`方向移動(dòng)，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。

第15頁(yè)/共41頁(yè)隨機(jī)引物標(biāo)記法原理

用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則不斷在其3`-OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。第16頁(yè)/共41頁(yè)末端標(biāo)記法原理（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個(gè)單標(biāo)記的[α-32P]dNTP。第17頁(yè)/共41頁(yè)生物素光照標(biāo)記法

光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)加成反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。第18頁(yè)/共41頁(yè)4核酸分子雜交技術(shù)第19頁(yè)/共41頁(yè)

此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。4.1Southern印跡雜交第20頁(yè)/共41頁(yè)帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程第21頁(yè)/共41頁(yè)白瓷盤(pán)玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜第22頁(yè)/共41頁(yè)。第23頁(yè)/共41頁(yè)真空轉(zhuǎn)膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子+-真空轉(zhuǎn)膜第24頁(yè)/共41頁(yè)第25頁(yè)/共41頁(yè)第26頁(yè)/共41頁(yè)4.2Northern印跡雜交

與Southern雜交類似。檢測(cè)目的RNA的存在與否及含量。第27頁(yè)/共41頁(yè)4.3Western印跡雜交

將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。第28頁(yè)/共41頁(yè)4.4斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交Dotblottingandslotblotting

適于核酸樣品定性檢測(cè)，而不是定量檢測(cè)。第29頁(yè)/共41頁(yè)4.5原位雜交

insituhybridization分為菌落、噬菌斑及真核細(xì)胞原位雜交Home第30頁(yè)/共41頁(yè)5生物芯片

生物芯片（biochip）是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是指通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速與大信息量的檢測(cè)。第31頁(yè)/共41頁(yè)5.1生物芯片的分類(1)DNA芯片(Genechip,DNAchip,DNAmicroarray)(2)蛋白質(zhì)芯片(Proteinchip)(3)芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)第32頁(yè)/共41頁(yè)基因芯片：是指將大量探針?lè)肿庸潭ㄔ谖矬w表面，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。它以其可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息而顯示巨大威力。目前，基因芯片已經(jīng)應(yīng)用于基因表達(dá)檢測(cè)、尋找新基因、雜交測(cè)序、基因突變等許多方面?；蛐酒?3頁(yè)/共41頁(yè)蛋白芯片：是以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測(cè)對(duì)象，比基因芯片更進(jìn)一步接近生命活動(dòng)的物質(zhì)層面，因而有著比基因芯片更加直接的應(yīng)用前景。蛋白芯片第34頁(yè)/共41頁(yè)芯片實(shí)驗(yàn)室：是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。它將樣品制備、生化反應(yīng)和檢測(cè)分析的全過(guò)程集約化，形成微型分析系統(tǒng)。目前，這種形式尚處于研發(fā)階段。芯片實(shí)驗(yàn)室第35頁(yè)/共41頁(yè)5.2DNA芯片技術(shù)的基本原理DNA芯片技術(shù)的基本原理是分子識(shí)別，與Southern雜交和Northern雜交同出一理，即DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)和序列互補(bǔ)原理。第36頁(yè)/共41頁(yè)據(jù)芯片的性能與用途分：

1）毛細(xì)管型微芯片

2）基因探針型微芯片據(jù)DNA芯片上微排列的DNA不同分：

1）寡核苷酸芯片

2）cDNA芯片5.3DNA芯片的類別第37頁(yè)/共41頁(yè)◆