第五章基因的分離與鑒定第1頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離重組體DNA分子的構建及導入受體細胞基因克隆的實驗方案克隆基因的分離重組子的選擇與鑒定第2頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一克隆基因的分離

1.應用核酸探針

2.應用差別雜交或扣除雜交法

3.應用mRNA差別顯示技術

4.應用表達文庫

5.酵母雙雜交體系第3頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

應用核酸探針分離克隆的目的基因第4頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一步驟：1.獲得探針2.轉(zhuǎn)膜3.雜交第5頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一TransfertheDNAintheplaqueorcolonytoaNylonornitrocellulosemembranePhageDNAbindtothemembranedirectly

BacterialcoloniesmustbelysedtoreleaseDNAonthemembranesurface.Hybridization

(inasolutionContainingNucleicacidprobe)Washto

removeunhybri-dizationprobeand

visualize

X-rayfilm(radio-activelylabeled

)

antibodyorenzyme(modifiednucleotidelabeled

Lineup

thehybridizatedregionorrepeatedhybridization(Alkalitreatment)第6頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一探針的來源1.某種生物實驗體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中分離相關基因的核酸探針。

2.根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），往往由彼此相鄰的6~7個氨基酸組成。

第7頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一寡核苷酸探針的人工合成

1.探針的長度；要使探針與目的基因序列嚴格互補，最少的探針長度15~16個核苷酸，實驗中為保證足夠的特異性，通常使用17~20個核苷酸。

2.簡并性；根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸組分合成的寡核苷酸探針，通常是混合物的形式。在這種探針庫中，只有一種是與目的基因完全互補的。第8頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補的，其它的探針有可能與不相關的片斷雜交，產(chǎn)生假陽性信號。

1.猜測體探針

2.PCR-猜測體探針第9頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

猜測體：一種人工合成的用于分離克隆基因的低簡并性的寡核苷酸探針，其核苷酸序列是根據(jù)特定物種當中某種已知蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率，同時又采納了根據(jù)猜測最可能在目的基因中出現(xiàn)的密碼子資料，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進行合成。一種較長的唯一的寡核苷酸序列，它能夠大范圍的卻不能夠完全的同靶序列互補。第10頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第11頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一PCR-猜測體探針（尿酸氧化酶基因）根據(jù)末端32個氨基酸序列，設計PCR簡并引物，以cDNA為模板用猜測探針雜交篩選陽性克隆第12頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一應用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因第13頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一差別雜交（differentialhybridization）又稱差別篩選(differentialscreening)

適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達的mRNA的cDNA?？鄢s交（subtractivehybridization）又叫扣除cDNA克?。╯ubtractivecDNAcloning）通過構建扣除文庫得以實現(xiàn)。第14頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一差別雜交：需要兩種不同的細胞群體（目的基因正常表達、目的基因不表達），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針平行雜交，對有表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆文庫進行篩選。第15頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第16頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一差別雜交的局限性：

1.雜交靈敏度低，對于低峰度的mRNA尤為明顯

2.工作量大，重復性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導致雜交信號不一致。第17頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

扣除雜交：去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集。第18頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第19頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一應用mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR）分離克隆的目的基因

(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)第20頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一原理：用3’-端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機引物組成引物對，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進行PCR擴增（DDRT-PCR），在標準的序列膠中電泳2~3小時，可顯示出50~100條長度在100~5000bp之間的DNA條帶。第21頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

P.Liang等人設計合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。mRNA:5’-NMAAAAAA…AA-3’(12種序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’

3’-錨定引物：第22頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第23頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一10-mer，更好的同第一鏈結合，從而呈現(xiàn)出更多種的mRNA。一般用20種隨機引物和12種3’-端錨定引物組成的全部240組引物對PCR擴增后，所產(chǎn)生的大約20000條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細胞中所表達的全部的mRNA。5’-隨機引物第24頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

由于在cDNA群體中，代表特定細胞類型或發(fā)育階段的mRNA的含量非常低，所以要把一種只在某一階段或某種細胞類型中表達、而在另一發(fā)育階段或某種細胞類型中不表達的目的基因分離出來，就需要PCR擴增。DDRT-PCR第25頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一1.從一對處于不同發(fā)育階段（或不同基因型）的細胞群體中分離總mRNA，并用3’-端錨定引物作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;2.用5’-端隨機引物和3’-端錨定引物組成的引物對，在加入放射性同位素標記的dNTP的條件下，以第一步反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板進行PCR擴增。

3.將擴增樣品在變性的DNA測序膠中進行電泳分離基本過程：第26頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一4.將有關的差別表達的DNA條帶從測序膠上切割下來回收其DNA片斷；5.膠塊中的DNA量非常少，不能用于克隆，需進行二次擴增；6.將克隆的特定的DNA分別同基因組DNA及總mRNA作Southern或Northern雜交，測序；7.以此目的片斷作探針從cDNA文庫中或基因組文庫中篩選全長的cDNA克隆或基因組克隆。第27頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第28頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一1.可以同時比較多個樣品表達的差異；

2.可以同時檢測“上游”及“下游”的基因；

3.檢測靈敏度高，所需樣品少，經(jīng)PCR擴增一些低峰度的mRNA也可以被檢測出來；

4.結合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項技術，使本方法顯得較單方便。優(yōu)點：第29頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

1.假陽性比例高（50%～75%）；同一長度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時，造成人為誤差；mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針

2.擴增的差別條帶分子長度比較短?。?10～450bp）；

局限性：第30頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

應用表達文庫分離克隆的目的基因第31頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

當沒有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫的探針時，將cDNA克隆在表達載體上，再導入大腸桿菌寄主細胞然后通過對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的鑒定，分離克隆的真核目的基因。表達文庫分離克隆的目的基因第32頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一1.表達的蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式存在，其中原核蛋白質(zhì)的氨基酸序列是整合在真核蛋白質(zhì)的一個末端，不易被原核細胞中的有關蛋白酶消化降解，因而顯得比較穩(wěn)定，可以得到較高的表達水平。2.cDNA片斷必須置于啟動子序列下游，在其控制之下；按正確的取向和讀碼結構插入，確保產(chǎn)生正確的蛋白質(zhì)。特點：第33頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一1.利用抗體篩選表達文庫；

2.測定蛋白質(zhì)的功能；

3.用放射性同位素標記的、帶有特定蛋白質(zhì)結合位點的DNA片斷作探針篩選表達文庫。篩選的方法：第34頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一將菌落或噬菌斑原位復制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結合的抗體，加入經(jīng)標記的第二抗體能與第一抗體結合抗體篩選表達文庫第35頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

生物化學研究表明，存在Ca＋＋離子的條件下，鈣調(diào)蛋白能與許多種酶結合形成穩(wěn)定的復合物。將放射性同位素標記得鈣調(diào)蛋白用作探針篩選cDNA表達文庫，鑒定能夠表達出與它特異性結合的目標蛋白質(zhì)的陽性克隆。2.測定蛋白質(zhì)的功能第36頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

鑒定能夠表達出與特定DNA片斷（真核啟動子中與轉(zhuǎn)錄因子結合的DNA元件）結合的目標蛋白質(zhì)的克隆。3.用放射性同位素標記的、帶有特定蛋白質(zhì)結合位點的DNA片斷作探針篩選表達文庫第37頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一酵母雙雜交體系

（two-hybridsystem）第38頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。應用于真核基因地表達調(diào)控，細胞粘合因子間的相互作用、信號轉(zhuǎn)導通路以及細胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等研究酵母雙雜交體系又叫相互作用陷阱(interactiontrap)第39頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個結構上可以分開的、功能上相互獨立的結構域組成（example）；應用重組DNA技術，也可以將來自同一個轉(zhuǎn)錄因子的、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開的兩種結構域，在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活UAS（上游激活序列）下游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因的表達?；驹恚旱?0頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸區(qū)段有一個結合域（DNA-bindingdomain,DNA-BD）；在C端768～881位氨基酸區(qū)段有一個轉(zhuǎn)錄激活域（transcriptionactivationdomain,AD）DNA-BD能識別激活序列并與之結合；AD通過同轉(zhuǎn)錄機制中的其它成份之間的結合作用啟動下游基因進行轉(zhuǎn)錄。用DNA重組技術將它們分開，即使在同一個寄主中表達，也不會直接發(fā)生相互作用不能激活相關的效應基因進行轉(zhuǎn)錄。Example:第41頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一寄主菌株：剔除掉GAL4基因的釀酒酵母1.SFY526和HF7c帶有報告基因lacZ、HIS3和LEU22.還有兩種可以在大腸桿菌和酵母中自主復制的穿梭載體a.

pGBT9(DNA-BD)：靶基因是按正確的取向和讀碼結構被克隆在載體的多克隆位點區(qū)內(nèi)，于是靶蛋白和GAL4-BD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)b.第二種質(zhì)粒載體pGAD424(AD質(zhì)粒載體)用來構建cDNA表達文庫專用載體，克隆cDNA片斷是按正確的取向和讀碼結構插入在載體的多克隆位點區(qū)內(nèi)，因此由cDNA

編碼的蛋白質(zhì)便會同GSL4-AD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)。

第42頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第44頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第45頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；構建帶有GAL1UAS-啟動子-lacZ（His3）的轉(zhuǎn)化載體;把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構成cDNA表達文庫。從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。

e.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。酵母雙雜交體系的主要實驗過程：go第46頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

1.遺傳檢測法

2.物理檢測法

3.菌落或噬菌斑雜交篩選法

4.免疫化學檢測法

5.蛋白質(zhì)篩選法

6.轉(zhuǎn)譯篩選法重組子分子的選擇與鑒定第47頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

重組子、目的重組子與非目的重組子由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子第48頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

該方法要求克隆基因能夠表達，并利用相應的基因突變型作為受體細胞，當受體細胞由突變型變?yōu)橐吧蜁r或賦予受體細胞特定的表型時，我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因優(yōu)點：簡便、快速，結果較可靠缺點：基因必須表達并具有合適的受體細胞遺傳檢測法第49頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一1.根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法

a.抗藥性記號插入失活選擇法

b.β-半乳糖苷酶顯色反應選擇法第50頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第51頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一抗藥性篩選法的基本原理抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs第52頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一抗藥性篩選法的基本操作：先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生長、但在Ap和Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為重組子第53頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：

顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等第54頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一顯色篩選法的基本操作

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落第55頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一2.根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法

轉(zhuǎn)化進來的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變體發(fā)生體內(nèi)抑制或互補效應，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。第56頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一Example:

λgt.λB噬菌體（由于C片斷的缺失而造成重組缺陷的λred－噬菌體），在大腸桿菌ligts菌株上生長不能形成噬菌斑，在有連接酶功能的大腸桿菌lig＋菌株上形成噬菌斑。將具有連接酶基因的重組體噬菌體λgt.λB，涂布在大腸桿菌ligts菌株上時，通過寄主細胞的互補作用，能夠形成噬菌斑。根據(jù)形成噬菌斑這種表型特征，直接選擇具野生功能的重組體噬菌體。

第57頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一缺點：不單要求克隆的DNA片斷必須大到括足以包含一個完整的基因，而且還要求所編碼的基因能夠在大腸桿菌中實現(xiàn)功能表達。（對于真核基因很難達到要求）第58頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一物理檢測法

1.凝膠電泳檢測法

利用凝膠電泳的方法，鑒定外源片斷是否插入及其長度

優(yōu)點：簡便、快速

缺點：只能提供克隆片段大小的信息

第59頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一2.R-環(huán)檢測法：鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源區(qū)域

在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度的甲酰胺溶液中（70%），雙鏈的DNA-RNA分子比雙鏈的DNA-DNA分子更加穩(wěn)定。在這種條件下，RNA會同它的雙鏈DNA分子中的互補序列退火形成穩(wěn)定的RNA-DNA，而被取代的另一條DNA呈單鏈狀態(tài)。這種由雙鏈RNA-DNA和單鏈DNA形成的泡狀體稱R-環(huán)結構第60頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一第61頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

包括菌落或噬菌斑的原位雜交技術

優(yōu)點：方法簡便、快速。

缺點：必須具有相應的探針。分子雜交技術檢測法第62頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設計并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補雜交是該技術的基本理論依據(jù)第63頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一菌落原位雜交法的基本操作：用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜用X光膠片覆蓋薄膜感光第64頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

利用免疫學的原理，檢測克隆基因的表達產(chǎn)物。免疫化學檢測法第65頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一

該方法類似于原位雜交法優(yōu)點：方法簡便，一次可檢測大量的克隆子缺點：克隆基因必須表達并具有相應的抗體1.放射性抗體檢測法第66頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一1.免疫血清含有幾種IgG抗體，識別抗原分子上不同定子，并分別同各自識別的抗原定子相結合；

2.抗體分子或抗體的F（ab）部分，能夠牢固的吸附在固體基質(zhì)上（聚乙烯等塑料制品），而不容易被洗脫掉；

3.通過體外碘化作用，IgG抗體會迅速的被放射性同位素125I標記上。

原理：第67頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一1.菌落溶解釋放出抗原蛋白質(zhì)；

a.把平板放置在氯仿蒸氣中；

b.用烈性噬菌體的氣溶膠噴灑；

c.用帶有能被熱誘發(fā)的原噬菌體的寄主菌處理。2.將連結在固體支持物上的抗體緩慢的同溶解的細胞接觸，形成抗原－抗體復合物3.將固體支持物取出，與放射性標記的第二種抗體溫育；4.放射自顯影檢測。步驟：第68頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板用固定了特異性抗體的聚乙烯薄膜影印裂解平板輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定與II125標記的IgG保溫洗滌、干燥、感光放射免疫原位雜交鑒定第69頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一細菌菌落溶解，釋放出抗原蛋白質(zhì)第70頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一雙位點檢測法：適用于含有雜種多肽菌落分析。雜種多肽A–B

（A）抗體（B）抗體固定在固體基質(zhì)125I標記第71頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一濾膜抗體溶液放射性標記抗體檢測法的操作程序聚乙烯薄膜培養(yǎng)皿及菌落放射性標記抗體檢測法的操作程序第72頁，共80頁，2023年，2月20日，星期一