大麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理和使用方法。掌握淀粉酶活力測定的一般方法。了解大麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。實(shí)驗(yàn)原理

幾乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌發(fā)的禾谷類種子，淀粉酶活性最強(qiáng)。種子萌發(fā)時(shí)，淀粉酶活性隨萌發(fā)時(shí)間迅速增加，將淀粉分解成小分子糖類，供幼苗生長。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶兩種。α-淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。β-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解生成麥芽糖。儀器、原料和試劑

儀器：小臺(tái)秤；具塞刻度試管25ml×13；；研缽；容量瓶50ml×2、100ml×1；離心機(jī)；分光光度計(jì)；恒溫水??；移液管。原料：大麥種子試劑：（1）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）：稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100ml（要求嚴(yán)格仔細(xì)操作）；（2）0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液：A液（0.1mol/L檸檬酸）—稱取分析純檸檬酸21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L；B液(0.1mol/L檸檬酸鈉)—稱取檸檬酸鈉29.41g用蒸餾水溶解并定容至1L；取A液55ml與B液145ml混勻，即為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液；（3）1%淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100ml0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液中。（4）3，5-二硝基水楊酸（DNS）：精確稱取1g3，5-二硝基水楊酸溶于20ml2M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100ml，蓋緊瓶塞，防止CO2進(jìn)入。若溶液混濁，可過濾。實(shí)驗(yàn)步驟種子萌發(fā)：大麥種子浸泡2.5h后，放入25℃恒溫箱內(nèi)或室溫下發(fā)芽。大麥萌發(fā)所需要的時(shí)間與品種有關(guān)。若難以萌發(fā)，可適當(dāng)延長浸泡時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間。酶液提?。悍Q取萌發(fā)3天的大麥種子1.0g（芽長1.0~1.5cm），置研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，用8ml蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔數(shù)分鐘振蕩1次，使其充分提取。然后3000r/min離心10min，取上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml，放入50ml容量瓶中（稀釋程度視酶活性大小而定），用蒸餾水定容至刻度搖勻，即為淀粉酶稀釋液，進(jìn)行酶活力測定。取干燥種子或浸泡2.5h后的種子1.0g作為對(duì)照，按上述步驟進(jìn)行提取操作。4．酶活力測定：取25ml刻度試管5支，編號(hào)，按下表要求加入試劑。搖勻，置于水浴中煮沸5min,取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至25mL。搖勻，以5號(hào)管為對(duì)照在520nm波長下比色，記錄光密度值，從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，用以表示酶活性。試管標(biāo)號(hào)試劑加入量/ml12345干燥種子的酶提取液干燥種子的酶提取液重復(fù)萌發(fā)幼苗的酶提取液萌發(fā)幼苗的酶提取液重復(fù)空白管酶稀釋液1.01.01.01.00DNS（ml）00002.0預(yù)保溫將各試管和淀粉溶液置于40℃恒溫水浴中保溫10min1%淀粉溶液11111保溫在40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min

DNS（ml）2.02.02.02.02.0計(jì)算根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關(guān)系，即：A標(biāo)準(zhǔn)/A未知=C標(biāo)準(zhǔn)/C未知，則C（酶液管濃度）=A酶×C標(biāo)準(zhǔn)/A標(biāo)準(zhǔn)式中C—濃度；