疾病相關基因的發(fā)現(xiàn)及功能研究演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有91頁\編輯于星期二（優(yōu)選）疾病相關基因的發(fā)現(xiàn)及功能研究現(xiàn)在是2頁\一共有91頁\編輯于星期二人類基因組及表達概況人類單倍體基因組由3.2xl06bpDNA組成，含有2～3萬個基因在一般情況下任何類型的細胞大約只表達一部分基因，約產(chǎn)生5000-15000種蛋白質(zhì)每一特定發(fā)育時期或每種組織特異表達其基本與獨特的蛋白質(zhì)正常成人體內(nèi)約含有250種以上不同類型細胞現(xiàn)在是3頁\一共有91頁\編輯于星期二每種細胞大約表達300—400種不同于其他細胞的特異性蛋白質(zhì)脊椎動物細胞總蛋白的35％80％在各種組織之間互不相同而構(gòu)成所謂標志蛋白，也稱看家基因如糖代謝、DNA修飾和蛋白合成等有關酶的選擇性表達基因多為低豐度的基因我們對其中絕大部分基因及表達產(chǎn)物功能尚不了解，在疾病中的意義不明現(xiàn)在是4頁\一共有91頁\編輯于星期二基因的表達調(diào)控基因的表達主要是通過：控制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的啟動轉(zhuǎn)錄的速度轉(zhuǎn)錄后的修飾控制翻譯實現(xiàn)翻譯的啟動翻譯后的修飾現(xiàn)在是5頁\一共有91頁\編輯于星期二基因差異性表達的研究策略現(xiàn)在是6頁\一共有91頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)錄水平：差異性表達mRNA水平分析

DDRT-PCR技術差減雜交抑制差減雜交基因表達系列分析(SAGE)翻譯水平:proteinelectrophoresis現(xiàn)在是7頁\一共有91頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)錄水平現(xiàn)在是8頁\一共有91頁\編輯于星期二方法基本要求尋找mRNA表達的差異,至少要滿足下列要求在一定時、空里,約有15000種mRNA表達/cell,除少數(shù)屬高豐度、大量的屬于低豐度表達,使用的方法足以顯示低豐度mRNA重復性要好實驗過程中能夠步步驗證比較得到的產(chǎn)物能代表相應的mRNAs或cDNAs,并能由此找到相應的cDNA序列省時,簡便易行現(xiàn)在是9頁\一共有91頁\編輯于星期二A、差減雜交(subtractivehybridization)差減雜交是利用目的基因在兩種組織或細胞中表達的差異，通過其mRNA或單鏈cDNA進行液相雜交，除去兩者之間相同的基因成分取得?，F(xiàn)在是10頁\一共有91頁\編輯于星期二ControlExperimentmRNART→cDNA標記生物素不標記生物素現(xiàn)在是11頁\一共有91頁\編輯于星期二Hybridization生物素親和層析柱未結(jié)合的洗脫下來克隆、測序得到差異表達基因現(xiàn)在是12頁\一共有91頁\編輯于星期二優(yōu)點利用降低了復雜度的差減文庫進一步作差異雜交，能夠顯著提高差異雜交的效率缺點目的基因片段的富集程度有限假陽性比例較高需大量的mRNA(>20mg)現(xiàn)在是13頁\一共有91頁\編輯于星期二B、抑制差減雜交(supressionsubtractivehybridization,SSH)原理：以抑制PCR為基礎的cDNA消減雜交方法：利用非目標序列片段兩端的長反向重復序列在退火時產(chǎn)生“鍋一柄”結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性地抑制非目標序列的擴增現(xiàn)在是14頁\一共有91頁\編輯于星期二TestControlmRNART→cDNARsaI/HaeIII酶切現(xiàn)在是15頁\一共有91頁\編輯于星期二TestcDNA分成兩部分連上接頭加入過量的controlcDNA變性后雜交連上接頭現(xiàn)在是16頁\一共有91頁\編輯于星期二第一次雜交

第一次雜交后有4種產(chǎn)物：a是單鏈testcDNAb是自身退火的testcDNA雙鏈C是test和control的異源雙鏈d是單鏈controlcDNA目的第一次雜交是使test單鏈cDNA均等化，使原來有豐度差別的單鏈cDNA的相對含量達到基本一致現(xiàn)在是17頁\一共有91頁\編輯于星期二原理豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA.目的由于testcDNA中和controlcDNA序列相似的片段大都和control形成異源雙鏈分子C，使testcDNA中的差異表達基因的cDNA得到大量富集現(xiàn)在是18頁\一共有91頁\編輯于星期二第二次雜交合并兩份雜交產(chǎn)物，另加上新的變性control單鏈，再次雜交退火只有第一次雜交后剩余的經(jīng)均等化和消減的單鏈testcDNA能與controlcDNA一起形成各種雙鏈分子這次雜交進一步富集了差異表達基因的cDNA,并產(chǎn)生了一種新的雙鏈分子e，這種分子的兩個5'端有兩個不同的接頭，正是由于這兩個不同的接頭，使其能在以后的PCR中被有效地擴增。現(xiàn)在是19頁\一共有91頁\編輯于星期二巢式(Nest)PCR兩次雜交后，填平粘性末端，利用巢式PCR(nestedPCR)原理進行擴增e型分子兩端都能和引物配對，擴增效率高c型的雙鏈分子只在一端有一個引物配對，擴增效率比e型分子低得多b型分子由于兩端有長序列的反向重復，可互補形成牢固的“鍋一柄”二級結(jié)構(gòu)，無法進行有效擴增e就是差異表達的基因現(xiàn)在是20頁\一共有91頁\編輯于星期二抑制消減雜交法的優(yōu)點降低假陽性率兩步雜交和兩步PCR，保證了該方法具有較高的特異性具有高度敏感性：它的均等化和對目標片段的富集，保證了低豐度mRNA也有被檢測的可能現(xiàn)在是21頁\一共有91頁\編輯于星期二抑制消減雜交法的缺點該方法若是mRNA量不夠，那么低豐度的差異表達基因的cDNA很可能會檢測不到其次，消減庫中的cDNA因為已被限制酶消化，不再是全長cDNA步驟繁瑣，工作量大現(xiàn)在是22頁\一共有91頁\編輯于星期二C、限制型差異顯示PCRmRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA再用同一限制酶(首先識別4bp的酶)消化cDNA并把酶切片段分別加上接頭后進行特異PCR擴增獲得差異表達片段現(xiàn)在是23頁\一共有91頁\編輯于星期二優(yōu)點通過使用限制酶將cDNA雜交度降低降低了雜交后無關重復序列對富集的靶序列的污染假陽性率相對低得多現(xiàn)在是24頁\一共有91頁\編輯于星期二缺點但RDA無法檢測缺乏合適內(nèi)切酶位點的表達序列類似抑制差異雜交技術，它只能獲得較短的靶基因探針，用幾個甚至幾十個探針分別去篩選全長cDNA絕不是一件容易的事情另一方面cDNARDA降低復雜性也可能造成一些信息的丟失現(xiàn)在是25頁\一共有91頁\編輯于星期二D、mRNADDRT-PCRmRNAdifferentialdisplayRT-PCRThreetechniquesRT:Reverse-Transcription:PCR:PolymeraseChainReactionPAGESequencegelelectrophoresis現(xiàn)在是26頁\一共有91頁\編輯于星期二ControlExperimentmRNARTPCR現(xiàn)在是27頁\一共有91頁\編輯于星期二PAGEelectrophoresisControlExperimentDownregulatedgeneUpregulatedgene現(xiàn)在是28頁\一共有91頁\編輯于星期二DifferentialDisplaygeneT-cloneSequenceInformaticsanalysis現(xiàn)在是29頁\一共有91頁\編輯于星期二VerifyNorthernblotRT-PCRTraltimeRT-PCRConclusion現(xiàn)在是30頁\一共有91頁\編輯于星期二GenefunctionanalysisOverexpressionRNAiTissuedistributionSub-celllocationKnockoutTransgeneInvitroanalysisInvivoanalysisImmunohistologyConfocal&Microscopy現(xiàn)在是31頁\一共有91頁\編輯于星期二優(yōu)點

同其他方法相比較微量樣品：僅需0.2μg總RNA作為起始材料高通量：可同時分析多組樣品敏感性：高,可檢出低豐度mRNA實驗周期：短,約8天即可完成,便于重復腳踏實地：步步驗證比較可簡單地將DD的特點概括為“3SRV”,即“Simplicity,Sensitivity,Speed,Reproducibility,Versatility”

現(xiàn)在是32頁\一共有91頁\編輯于星期二

同其他方法相比較一是假陽性多(約50%～70%)二是得到的有差異cDNA片段短(約為110～500bp)缺點現(xiàn)在是33頁\一共有91頁\編輯于星期二假陽性的原因提取總RNA時,有染色體DNA污染,此DNA作為模板在PCR過程中被擴增從聚丙烯酰胺膠上挑選有差異條帶時,實驗組與對照組間信號對比不夠顯著在克隆階段挑選陽性菌落時,未能排除基因克隆中的假陽性研究中多次使用PCR技術,很難避免實驗室環(huán)境中的交叉污染現(xiàn)在是34頁\一共有91頁\編輯于星期二解決方法提取RNA操作嚴格,得到的RNA必須經(jīng)過脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化,去除染色體DNA污染切取有差異條帶時,首選實驗與對照間信號差異顯者,最好是互為有或無的關系;僅僅是強與弱的關系,放在次選位置上即使是差異顯著地顯現(xiàn)為一條帶,也不能肯定是由某一cDNA的均一分子泳動而成,有可能是結(jié)構(gòu)不同而分子量相同的cDNA共泳動的結(jié)果交叉污染問題的克服應服從分子生物學一般原則金標準：差異基因最終確認用Northern雜交現(xiàn)在是35頁\一共有91頁\編輯于星期二其它方法基因表達系列分析(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)DNA芯片(DNAChips)幾種方法的綜合運用現(xiàn)在是36頁\一共有91頁\編輯于星期二翻譯水平差異表達研究策略現(xiàn)在是37頁\一共有91頁\編輯于星期二蛋白質(zhì)水平分析蛋白質(zhì)組學：一個蛋白質(zhì)組是由一個基因組或任何細胞／組織表達的所有種類蛋白質(zhì)同一種mRNA可因不同的剪接或翻譯后加工產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，故一個蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)數(shù)量可超過相應基因組的基因數(shù)目現(xiàn)在是38頁\一共有91頁\編輯于星期二蛋白質(zhì)組學研究常用技術二維凝膠作圖(2D—gelmapping)：二維凝膠作圖是在同一塊凝膠上，一個面上依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(pI)，另一面上依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進行電泳，將各種不同蛋白質(zhì)分開，這種方法可同時分析數(shù)千種蛋白質(zhì)凝膠的高分辨率和高度重復是運用二維凝膠電泳分離許多種復雜蛋白質(zhì)混合物的前提現(xiàn)在是39頁\一共有91頁\編輯于星期二二維凝膠作圖方法2種方法：垂直平板凝膠(verticalslabgels)超薄水平凝膠(ultra-thinhorizontalgels)均采用梯度凝膠(9-16％聚丙烯酰胺)，可分離5--200kD蛋白現(xiàn)在是40頁\一共有91頁\編輯于星期二檢測根據(jù)實驗目標和所需靈敏度采用銀染、考馬氏亮藍或放射自顯影檢測采用激光密度掃描(laserdensitometer)、磷顯影儀(phosphor-imager)等掃描裝置現(xiàn)在是41頁\一共有91頁\編輯于星期二結(jié)果分析現(xiàn)在是42頁\一共有91頁\編輯于星期二二維凝膠參照圖譜(2D-gelreferencedmaps)利用電子計算機分析構(gòu)建二維凝膠參照圖譜最后通過微測序、肽圖(peptidmapping)、免疫和cDNA短暫超表達等研究最后確立蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并與蛋白數(shù)據(jù)庫及DNA數(shù)據(jù)庫的信息進行比對、分析得出結(jié)論現(xiàn)在是43頁\一共有91頁\編輯于星期二腦缺血/缺氧相關基因的克隆現(xiàn)在是44頁\一共有91頁\編輯于星期二研究背景、目的腦缺血（缺血性中風）特點：常見病、多發(fā)病、高致殘率、高死亡率，年新發(fā)病例超過150萬腦缺血致腦損傷機理:自由基、能量消耗、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、細胞凋亡學說目前存在的問題：腦缺血發(fā)病機理復雜、涉及的許多環(huán)節(jié)尚未完全闡明、作用靶點缺乏特異性，臨床療效不佳。目標：尋找新的靶點體內(nèi)存在腦缺血保護性因素，我們的研究目的就是揭示和闡明這些內(nèi)在保護性機制，尋找新的預防和治療腦缺血的靶點現(xiàn)在是45頁\一共有91頁\編輯于星期二研究技術路線

制作MCAO大鼠腦缺血模型↓熒光差異顯示PCR

↓

腦缺血相關差異顯示EST片段的獲得↓

差異顯示EST片段的篩選確認

↓

獲取目標基因全長

↓

生物信息學分析研究

↓↓

制備抗體基因表達的功能研究

↓過表達RNAi轉(zhuǎn)基因動物

↓↓↓↓

組織表達譜分析體內(nèi)外體內(nèi)外子代性狀研究

現(xiàn)在是46頁\一共有91頁\編輯于星期二

動物：250-280gSD雄性大鼠。采用MCAO(MiddleCerebralArteryOcclusion)大腦中動脈栓塞模型：TTC染色結(jié)合動物行為學改變確認模型成功取大鼠腦缺血2小時

缺血側(cè)組織非缺血側(cè)組織進行研究腦缺血模型的制作RLR:ischemia;L:non-ischemiaStainwithTTC現(xiàn)在是47頁\一共有91頁\編輯于星期二缺血與非缺血組織RNA的提取提取RNA的純度和完整性純度檢驗：

A260/A280＝1.96

完整性檢驗：電泳結(jié)果見圖2Fig2TheelectrophoresisofRNAofcerebralischemiaandnon-ischemia現(xiàn)在是48頁\一共有91頁\編輯于星期二

差異顯示PCR結(jié)果(圖譜)現(xiàn)在是49頁\一共有91頁\編輯于星期二NumberAlignmentresultfromGenBankNumberAlignmentresult81Homosapiensnuclearmatrixprotinp8425New10Cysteinedioxygenase54New12MusmusculusCCR4-NOTtranscriptioncomplexR51NewR34Musmusculusab1-interactor1R66NewR41HomosapiensCG-99proteinR81NewR71MIR16R92NewR101Tissueinhibitorofmetalloproteinase3geneR111NewR162Homosapiensnuclearreceptorco-repressorR122NewR123Tissueinhibitorofmetalloproteinase3geneR132NewR18PeptideChainReleaseFactor1R19BACcloneRP24-462J14fromchromosome19部分差異片段測序結(jié)果表

1FDDRT-PCR差異顯示EST序列同源性分析結(jié)果(2001年分析結(jié)果).Tab.1TheblastresultsofsequenceassayfromdifferentialdisplaybyFDDRT-PCR.現(xiàn)在是50頁\一共有91頁\編輯于星期二小結(jié)共獲得了146個與腦缺血相關的EST片段。其中9個為新的EST片段。現(xiàn)在是51頁\一共有91頁\編輯于星期二腦缺血相關基因YZ-2的篩選及確認現(xiàn)在是52頁\一共有91頁\編輯于星期二差異顯示基因初篩Fig4,5,6RT-PCRscreening(20fragment)采用RT-PCR技術進一步驗證已經(jīng)克隆的EST片段的在腦缺血中的差異表達456現(xiàn)在是53頁\一共有91頁\編輯于星期二反相NorthernBlot印跡分析結(jié)果Fig9PartialDotNorthernBlotanalysis現(xiàn)在是54頁\一共有91頁\編輯于星期二差異表達EST片段的生物信息學分析Fig3BlastanalysisresultsfromGeneBank現(xiàn)在是55頁\一共有91頁\編輯于星期二片段R6RT-PCR的結(jié)果R6β-actinM:Marker;Lane1:Non-ischemia;Lane2:β-actin;Lane3:Ischemia;Lane4:β-actinFig8RT-PCRresultofR6(n=6)*P<0.001Fig9ThevolumeratioofR6andβ-actinbandinRT-PCR現(xiàn)在是56頁\一共有91頁\編輯于星期二R6片段的RT-PCR半定量分析結(jié)果表

2R6與β-actinRT－PCR擴增產(chǎn)物的灰度掃描體積比值

Table2ThevolumeratioofR6andβ-actinbandinRT-PCRGroupnVR6/mm3

Vβ-actin/mm3VR6/mm3/Vβ-actin/mm3Ischemia6382910±5892

201876±2374

1.8968±0.2356*Non-ischemia6109823±1562213875±31220.5135±0.1021

Comparewithnon-ischemia*P<0.001現(xiàn)在是57頁\一共有91頁\編輯于星期二大鼠腦缺血相關基因EST片段R6的確定Fig

10PartialFDDRT-PCRResultsFig112002-3-5BlastResultFig12DotblotResultsFig13RT-PCR101112R6β-actin13

小結(jié)現(xiàn)在是58頁\一共有91頁\編輯于星期二YZ-2基因全長的克隆現(xiàn)在是59頁\一共有91頁\編輯于星期二

利用5‘RACE技術克隆R6全長

5’RACE主要步驟

RNA的制備

↓

片斷特異引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA↓RNA連接酶環(huán)化

↓

NestPCR反應↓產(chǎn)物TA克隆測序

Fig14Mechanismof5’RACE現(xiàn)在是60頁\一共有91頁\編輯于星期二

第一輪5‘RACE引物的設計RT：5’-TGGTGTCTAATGCTC-3’

F1：5'-AGGTCTTAGGTTCCTTTTGAGTCTG-3’R1：5'-GTGCTTGCTGACATGTACTGTTGC-3’GCAACAGTACATGTCAGCAAGCACS2：5’-CCTTCTCTTTGTAAGTTCTGTTGAG-3’A2：5’-ATAGCCATACTGTTCCCTAGCAG-3’CTGCTAGGGAACAGTATGGCTAT

5’ATTACAGGCAAATTGGGCATACTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTTAAATACTTGGCGTAATCATGGTNATACTTGTTTCTGTGTGAAACAGGACTGCTAGGGAACAGTATGGCTATTATAAAACACCTTTCAAGTATGAACTGCATGTTTGTTCAATGTCTTTCCGGTGGAATAATTCCTAGCAAGCAACAGTACATGTCAGCAAGCACATGTGTTGAAGGCTAAGATATAAATTTTGAAAAACTACAATAGNAACAAAAGTAAAGGTCTTAGGTTCCTTTTGAGTCTGTCAACCACACACTATTATATTAAATTGTCATTATTATTTTCATAGAAGAAAATGTATATTATTTCTTTTGATCTTTACAGGACATGAATAGAAATAATGTTTATTTATATAGAACCTAAGCAAAAATCCTCATATATATGTTCAAGTCATCACAGCATGAGTAATTTTGAAGTTTTAACTCACCCCCCTTCTCTTTGTAAGTTCTGTTGAGCATTAGACACCAGTAAAANTATTTTAAACCCGAAAAAAAAAA

3’現(xiàn)在是61頁\一共有91頁\編輯于星期二NestPCR產(chǎn)物的電泳圖15Fig151stPCRofNestPCRFig162ndPCRofNestPCRM:marker;Control:BlankControl;R+F:Upper+lowerprimer;F:Upperprimer;R:lowerprimer16現(xiàn)在是62頁\一共有91頁\編輯于星期二RACEPCR產(chǎn)物的克隆及酶切鑒定按照常規(guī)方法進行凝膠回收與T載體的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒DNA的抽提及酶切鑒定(見圖17)Fig17TAsubcloneandIdentifypositiveclonesbyrestricatedenzymeEcoRIdigestion.

Lane1,2,3,4:TheplasmidwerenotdigestedbyEcoRI.

LaneM:Marker.Lane5,6,7,8:Thelane1andlane2plasmidsweredigestedbyEcoRI.

現(xiàn)在是63頁\一共有91頁\編輯于星期二第一輪測序圖譜Fig18Sequenceresultsofproductfromfirst5’RACE

現(xiàn)在是64頁\一共有91頁\編輯于星期二NorthernBlot印跡分析結(jié)果Fig19Northernblotresults.LaneM:markerLaneR6:ischemialateral

現(xiàn)在是65頁\一共有91頁\編輯于星期二22NorthernBlot確認YZ-2差異表達Fig22:Afterusingnon-DIGlabeledprobe:DIGlabeledprobe=50:1

2021Fig20:BeforehybridizationLaneL:Nonischemia;LaneR:IschemiaFig21:Afterhybridization現(xiàn)在是66頁\一共有91頁\編輯于星期二第二輪RACE引物設計Northern印跡分析我們尚未獲取YZ-2基因全長，在首輪RACE的序列靠近5‘端的位置設計引物。RT：5’-CCAAATGAAGTCTTACCT-3’A2：5’-AGGAGGAAACTGAGGCCCAGAGAAG-3’S2：5’-AGGCTGTAATCAGAGCTGCCGTATG-3’A1：5’-TGGCGGTTCTGAAGGTCGGGATAGT-3’S1：5’-GGACTGGGCATCAGGGTCTCCACT-3’現(xiàn)在是67頁\一共有91頁\編輯于星期二第二輪RACEPCR電泳圖譜Fig231stPCRofNestPCRFig242ndPCRofNestPCRM:marker;Control:BlankControl;R+F:Upper+lowerprimer;F:Upperprimer;R:lowerprimerFig23Fig24現(xiàn)在是68頁\一共有91頁\編輯于星期二R6全長的拼接5’3’EST片段第二次RACE片段2778bp第一次RACE片段1500bp543bp4821bp將R6命名為YZ-2基因。現(xiàn)在是69頁\一共有91頁\編輯于星期二小結(jié)成功建立了利用5‘RACE技術克隆未知基因序列的策略，成功克隆出YZ-2基因全長，NorthernBlot印跡分析證實了該結(jié)果。NorthernBlot印跡分析進一步確認了YZ－2基因在腦缺血中出現(xiàn)上調(diào)差異表達?，F(xiàn)在是70頁\一共有91頁\編輯于星期二YZ-2基因功能的研究生物信息學分析現(xiàn)在是71頁\一共有91頁\編輯于星期二生物信息學分析網(wǎng)站和工具進行基因/蛋白質(zhì)功能分析的網(wǎng)站和工具：：ProtScale交互式在線電腦分析軟件：Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫：DNASTAR電腦分析軟件現(xiàn)在是72頁\一共有91頁\編輯于星期二生物信息學對YZ-2蛋白一級結(jié)構(gòu)及理化特性的分析YZ-2蛋白一級結(jié)構(gòu)及理化特性：編碼氨基酸：244animoacids

理論等電點(pI):9.52

分子量(MW)：29280.0DA

酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu):2

堿性氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys):7

分子式（Formula）:C801H1203N217O234S6

原子總數(shù)（Totalnumberofatoms）:2461

預期半衰期（Estimatedhalf-life）:1hr(invitro)2min(yeast,invivo).2min(Escherichiacoli,invivo)現(xiàn)在是73頁\一共有91頁\編輯于星期二YZ-2基因編碼的氨基酸序列RHLPPPVDTGTENRTYQASSAAFRYTAGTPYKVPPTQSNTAPPPYSPSPNPYQTAMYPIRSAYPQQNLYAQGAYYTQPVYAAQPHVIHHTTVVQPNSIPSAIYPAPVAAPRTNGVAMGMVAGTTMAMSAGTLLTTPQHTAIGAHPVSMPTYRAQGTPAYSYVPPHW（244aa）現(xiàn)在是74頁\一共有91頁\編輯于星期二生物信息學對YZ-2抗原性的分析

抗原性分析（Antigenicity）(1)Score1.136length57atresidues54->110（Middle）(2)Score1.136length8atresidues156->163(C-terminal)(3)Score1.101length12atresidues138->149(C-terminal)(4)Score1.070length11atresidues42->52(N-terminal)(5)Score1.056length9atresidues17->25

(N-terminal)

現(xiàn)在是75頁\一共有91頁\編輯于星期二生物信息學同源性分析結(jié)果

核酸數(shù)據(jù)庫

1.GeneBank2.EMBL3.DDBJ

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫1.SWISS-PROT2.PDB

3.Prosite

與大鼠腦中的KIAA0280基因高度同源，同源性達96％。蛋白質(zhì)同源性分析表明:該蛋白質(zhì)序列為新的蛋白?，F(xiàn)在是76頁\一共有91頁\編輯于星期二

小結(jié)生物信息學分析結(jié)果：首次發(fā)現(xiàn)YZ-2為一新的蛋白質(zhì)。現(xiàn)在是77頁\一共有91頁\編輯于星期二YZ-2基因功能的研究抗體制備及皮層細胞體外缺氧模型的建立現(xiàn)在是78頁\一共有91頁\編輯于星期二免疫多肽的設計與合成

生物信息學對抗原性（Antigenicity）分析預測

Score1.136length8atresidues156->163Score1.101length12atresidues138->149144166

↓

↓

CPVSMPTYRAQGTPAYSYVPPHW

↓

化學合成↓含22aa的多肽（純度97％）現(xiàn)在是79頁\一共有91頁\編輯于星期二YZ-2多克隆抗體的制備抗體制備的步驟多肽+福氏佐劑乳化家兔皮下多點接種程序化多次注射抗體檢測

效價檢測(Elisa)特異性檢測(Westernblot)現(xiàn)在是80頁\一共有91頁\編輯于星期二多克隆抗體制備檢測結(jié)果Fig30Thevalencassayresultofmulti-cloneantinodyproducedfromrabbitbyman-madesynthezedpolypeptide.抗體效價1:25600現(xiàn)在是81頁\一共有91頁\編輯于星期二WesternBlot

分析圖31YZ-2在腦缺血組織中的表達的Western印跡分析Fig31ThewesternblotanalysisofexpressionofYZ-2incerebralischemiaLaneM:marker;Lane1:Ischemiafor0.5hr;Lane2:Control;Lane3:Ischemiafor2hrs;Lane4:Control.Arrowshowthemolecularweight(MW)ofYZ-2DaDa現(xiàn)在是82頁\一共有91頁\編輯于星期二大鼠皮層細胞體外缺氧模型的制備

實驗步驟:密閉容器內(nèi)放入培養(yǎng)7-8d的胎鼠皮層細