腫瘤自殺基因治療及中藥方藥的增效作用和機制第1頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二課題資助情況國家自然科學基金（編號：30171201;30572433;30672747

）廣東省科技攻關計劃（編號：2005B3030102）廣州市科委（編號：2002J1-C7401）廣東省中醫(yī)藥管理局（編號：A401028；1050079）廣州中醫(yī)藥大學(K0050031)

第2頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二內容

研究背景及研究思路HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構建中藥方藥對腫瘤自殺基因治療的增效作用中藥方藥增效作用的機制腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的改進工作第3頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二研究背景及研究思路第4頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二基因治療的概念基因治療就是將外源性基因導入到正?；虿∽兗毎校闷滢D錄或翻譯產物發(fā)揮治療作用的一種方法第5頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二基因治療的策略第6頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二基因治療的臨床試驗第7頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤的基因治療惡性腫瘤由于患者來源廣，用于治療的基因多，容易復制動物模型等原因而成為首選對象

第8頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二目前常用的腫瘤基因治療方案

腫瘤的免疫基因治療腫瘤抑制基因治療

自殺基因治療（最有應用前景）

腫瘤多藥耐藥性基因治療

抑制血管生成的基因治療第9頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二自殺基因的概念

所謂自殺基因是指在一定條件下，可以引起細胞自動死亡的基因

目前研究的多數自殺基因是通過編碼病毒或細菌的酶介導敏感性，這些酶能把藥物的無活性形式轉化為毒性代謝產物，引起細胞死亡第10頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二基因名稱底物產物旁殺傷效應備注單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）GCV，ACV，PCV，BCV，BVDU，BVDC，IVDU等核苷類似物磷酸化的核苷類似物有研究最多已上臨床水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶（VZV-tk）araMaraATP－

大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（EC-CD）5-FC5-FU有已上臨床大腸桿菌硝基還原酶（NTR）CB1954，MTZ，NFT羥胺衍生物有研究正在興起大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（EC-XGPRT或gpt基因）6TG6TX6-硫代鳥嘌呤酸有

細胞色素P450CYP2B1CPA，IFA堿性化的底物有

細胞羧肽酶G2（CPG2）CMDA芥類藥物有

大腸桿菌DeoD基因（PNP）Mep-dr6-甲嘌呤有

白細胞介素1β轉化酶（ICE）RARP，LaminsRb，U1-70kD等被降解失活的底物－

p53－－有

目前應用于實驗室和臨床主要的自殺基因治療系統(tǒng)

第11頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二自殺基因治療的優(yōu)勢①特異性殺傷基因表達細胞②殺傷多藥耐藥性（MDR）腫瘤細胞③基因的表達只需將一定量的前藥轉換成足以殺傷腫瘤細胞的劑量即可，而無需基因的長期表達④絕大部分自殺基因存在極明顯的“旁殺傷效應”，體外只需有10％以上的腫瘤細胞表達自殺基因，就可以殺傷絕大部分甚至全部腫瘤細胞⑤良好的瘤苗第12頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二旁殺傷效應

第13頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二旁殺傷效應作用機制

“縫隙連接”機制免疫介導機制“細胞凋亡”機制介質機制抗腫瘤血管生成

第14頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二縫隙連接機制第15頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二免疫介導機制tk+死亡大量抗原釋放免疫細胞浸潤細胞因子釋放免疫炎癥系統(tǒng)介導的非特異性殺傷誘發(fā)特異性抗腫瘤免疫反應12免疫抑制免疫激活免疫增強旁殺傷效應增強死亡第16頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二“細胞凋亡”機制自殺基因引起細胞死亡的形式為細胞凋亡tk+細胞凋亡形成凋亡小體為tk-細胞吞噬引起tk-細胞死亡細胞死亡tk-細胞第17頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二介質擴散

CD5-Fc5-Fu5-Fu5-Fu5-FuCD-細胞死亡第18頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二抗腫瘤血管生成注：自殺基因第19頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二單純自殺基因治療存在主要問題目的基因轉染率低而殺傷力不足；缺乏靶向性，自殺基因的表達缺乏組織特異性和時序性等，單純自殺基因治療難以完全消除腫瘤細胞第20頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤自殺基因療法的增效方法

雙自殺基因治療聯(lián)合治療聯(lián)合免疫基因治療聯(lián)合放射治療聯(lián)合化學治療聯(lián)合其他基因

靶向基因治療增強旁殺傷效應第21頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二單純自殺基因治療易復發(fā)聯(lián)合治療增效聯(lián)合免疫基因聯(lián)合放化療多基因間互相干擾，難以保證導入基因表達或長期表達；使用病毒載體量增多，潛在毒副作用增大；操作過程復雜，成本較高聯(lián)合中藥方藥載體轉染效率低靶向性不夠自殺基因療法聯(lián)合中藥方藥可能是一種更為有效和可行的方案研究思路增強免疫功能增強“縫隙連接”功能增強殺傷敏感性提高旁殺傷效應

肯定的免疫藥理作用多靶點作用給藥方便，價格低廉，毒副作用小或無明顯毒副作用第22頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構建

第23頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二技術路線獲得目的基因酶切酶切鑒定質粒重組病毒包裝和陽性克隆篩選病毒感染胃癌細胞重組質粒鑒定病毒滴度測定GCV殺傷試驗斑點雜交鑒定第24頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二目的基因（tk基因）的獲得

由美國匹茲堡大學藥理教研室HuangL.教授惠贈，廣州軍區(qū)總醫(yī)院趙亞剛博士提供（pICl9R/MCl-tk質粒）第25頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二pICl9R/MCl-tk質粒酶切鑒定結果12345a：pICl9R/MCl-tk質粒結構圖

b：pICl9R/MCl-tk質粒的酶切鑒定電泳圖譜

注（b）：1：Marker(λDNAHindⅢ)；2：pICl9R/MCl-tk質粒

3：pICl9R/MCl-tk質粒/BamHⅠ；4：pICl9R/MCl-tk質粒/BamHⅠ+EcoRⅠ5：Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)

第26頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二重組質粒的限制性內切酶鑒定結果

a：pLXSN-tk質粒結構圖b：pLXSN-tk質粒的酶切鑒定電泳圖譜1234561．DNAmarkerⅨ(分子量分別為2.5kb,2.0kb,1.5kb,1.0kb,500bp,300bp)2．pLXSN-tk經EcoRI單酶切3．4．pLXSN-tk經EcoRI/BamHI雙酶切5．pLXSN-tk質粒6．

DNA/EcoRI/HindⅢmarker第27頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二重組質粒的測序圖鑒定結果

第28頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二PT67包裝細胞篩選結果

a：G418篩選5d后的PT67b：篩選2w后形成的陽性克隆細胞圖3pLXSN-tk質粒轉染包裝細胞PT67結果第29頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二病毒滴度測定及結果

本實驗測定滴度最高為1×104cfu/mL第30頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二胃癌細胞tk基因的斑點雜交鑒定

123胃癌細胞SGC-7901、SGC-7901/tk的DNA與tk探針的斑點雜交圖注：1.pLXSN/tk質粒DNA（陽性對照）；

2.SGC-7901細胞DNA；

3.SGC-7901/tk細胞DNA

第31頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二GCV對人胃癌細胞SGC-7901的體外殺傷試驗

第32頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二結論及意義已成功已成功構建了逆轉錄病毒載體介導的HSV-tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)HSV-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)成功的構建，為后續(xù)的研究工作奠定了堅實的基礎

第33頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二中藥方藥對腫瘤自殺基因治療的增效作用第34頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二動物水平實驗第35頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二技術路線H22/tk＋和H22/tk－按1∶4混合接種小鼠皮下組織（2×106細胞）病毒感染肝癌細胞療效觀察動物分組GCV體外殺傷試驗成瘤后治療小鼠移植性肝細胞癌治療實驗(六味地黃)

第36頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二分組及治療

模型對照組正常對照組聯(lián)合治療組

六味地黃丸治療組

自殺基因治療組

（造模）第2天第6天第16天蒸餾水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理鹽水每天0.25mL

蒸餾水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理鹽水每天0.25mL

腹腔注射生理鹽水每天0.25mL

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1六味地黃丸懸液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1

蒸餾水灌胃每天0.5mL

六味地黃丸懸液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1（造模）（造模）（造模）（生理鹽水）第37頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤生長體積曲線時間（d）第38頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤質量及抑瘤率組別n腫瘤質量（g）抑瘤率（%）模型對照組191.5825±1.2380六味地黃治療組190.8498±0.716346.3自殺基因治療組200.9904±0.979637.4聯(lián)合治療組180.5859±0.3786*63.0注：*與模型對照組比較P<0.05抑瘤率=（模型組腫瘤質量－治療組腫瘤質量）/模型組腫瘤質量×100%第39頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤質量圖示第40頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二病理檢查結果(肉眼觀察)

注：第二組：腫瘤模型組；第三組：六味地黃丸治療組；第四組：自殺基因治療組；第五組：聯(lián)合治療組第41頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二病理檢查結果(光鏡觀察

)

模型對照組

腫瘤細胞數量較多，密集。六味地黃丸治療組腫瘤細胞數量較多，密集。自殺基因治療組腫瘤細胞數量密度相對較少。聯(lián)合治療組腫瘤細胞數量密度相對較低。各組細胞密度第42頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二模型對照組：腫瘤組織內腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結構的壞死組織六味地黃丸治療組：腫瘤組織內腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結構的壞死組織自殺基因治療組：腫瘤組織內腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結構的壞死組織聯(lián)合治療組：腫瘤組織內腫瘤細胞壞死，呈核固縮表現(xiàn)，并見大片紅染無結構的壞死組織。各組腫瘤壞死情況第43頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二模型對照組：腫瘤周邊纖維組織增生不明顯，未見明顯包膜六味地黃丸治療組：腫瘤周邊纖維組織增生較明顯，形成較明顯的假包膜自殺基因治療組：腫瘤周邊纖維組織增生較明顯，形成較明顯的假包膜聯(lián)合治療組：腫瘤周邊纖維組織增生較明顯，形成較厚的假包膜各組腫瘤纖維結締組織增生情況第44頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二模型對照組：腫瘤邊緣見少量炎細胞浸潤六味地黃丸治療組：腫瘤邊緣纖維結締組織內見較多量炎細胞浸潤自殺基因治療組：腫瘤邊緣纖維結締組織內見較多量炎細胞浸潤聯(lián)合治療組：腫瘤邊緣纖維結締組織內見大量炎細胞浸潤各組腫瘤組織炎細胞浸潤情況第45頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二肝癌治療實驗結論

自殺基因療法與六味地黃丸聯(lián)合應用于小鼠移植性肝細胞癌的治療具有協(xié)同效應，表明六味地黃丸對自殺基因治療小鼠移植性肝細胞癌具有增效作用第46頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二丹參注射液H22肝癌荷瘤小鼠剝落瘤塊照片A模型對照組；B丹參組；Ctk/GCV組；D聯(lián)合組.第47頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二技術路線tk＋和tk－細胞按1∶4混合接種小鼠皮下組織（1×106細胞）病毒感染黑色素瘤細胞療效觀察動物分組及治療GCV體外殺傷試驗小鼠移植性黑色素瘤治療實驗

第48頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二分組及治療

模型對照組正常對照組聯(lián)合治療組

六味地黃丸治療組

自殺基因治療組

（造模）第2天第7天第27天蒸餾水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理鹽水每天0.25mL

蒸餾水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理鹽水每天0.25mL

腹腔注射生理鹽水每天0.25mL

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1六味地黃丸懸液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1

蒸餾水灌胃每天0.5mL

六味地黃丸懸液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1（造模）（造模）（造模）（生理鹽水）第49頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二成瘤時間接種模型對照組六味地黃丸治療組自殺基因治療組聯(lián)合治療組

24681012141618202224262830第50頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二成瘤率第51頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤生長體積曲線時間（d）時間（d）第52頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤質量及抑瘤率注：*與模型對照組比較P<0.05

六味地黃治療組因有2只腫瘤較大的荷瘤小鼠后期死亡未能獲得腫瘤標本，該數據低于實際數據

抑瘤率=（模型組腫瘤質量－治療組腫瘤質量）/模型組腫瘤質量×100%組別n腫瘤質量（g）抑瘤率（%）模型對照組100.9583±1.3260自殺基因治療組110.3566±0.856962.8六味地黃治療組70.4369±0.693754.4聯(lián)合治療組100.1234±0.2538*87.1第53頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二各組腫瘤質量圖示注：六味地黃治療組因有2只腫瘤較大的荷瘤小鼠后期死亡未能獲得腫瘤標本，該數據低于實際數據第54頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二病理檢查結果(肉眼觀察)

注：B：腫瘤模型組；C：自殺基因治療組；D：六味地黃丸治療組；

E：聯(lián)合治療組第55頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二病理檢查結果(光鏡觀察

)

模型對照組

模型對照組：腫瘤組織內可見細胞密集，細胞內可見黑色素自殺基因治療組腫瘤組織內可見細胞密集細胞內可見黑色素六味地黃治療組腫瘤組織內可見密集的腫瘤細胞聯(lián)合治療組腫瘤組織內可見細胞密度稍降低各組細胞密度第56頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二模型對照組腫瘤內可見大片壞死組織自殺基因治療腫瘤內可見大片壞死組織六味地黃治療組腫瘤內可見大片壞死組織聯(lián)合治療組腫瘤內可見壞死組織各組腫瘤壞死情況第57頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二模型對照組腫瘤周圍無明顯胞膜形成自殺基因治療組腫瘤周圍見薄層假包膜六味地黃丸治療組：腫瘤周圍見薄層假包膜聯(lián)合治療組腫瘤周圍明顯的假包膜形成各組腫瘤纖維結締組織增生情況第58頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二模型對照組腫瘤周圍組織內見少量炎癥細胞浸潤自殺基因治療組腫瘤周圍組織內見少量炎癥細胞浸潤六味地黃丸治療組腫瘤周圍組織內有較多炎癥細胞浸潤聯(lián)合治療組腫瘤間質及周圍組織內見多量淋巴細胞浸潤各組腫瘤組織炎細胞浸潤情況第59頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二惡性黑色素瘤治療實驗結論六味地黃丸對自殺基因治療小鼠移植性惡性黑色素瘤具有增效作用第60頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二細胞水平實驗第61頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二中藥成分聯(lián)合tk/GCV系統(tǒng)對肝癌細胞的殺傷作用中藥成分對肝癌細胞的作用(確定篩選藥物及聯(lián)合用藥劑量)Q值法分析聯(lián)合作用是否有協(xié)同性有效中藥成分增效機制探討有效中藥成分對細胞周期、細胞凋亡率的影響有效中藥成分對肝癌細胞GJIC的影響自身旁殺傷效應檢測大鼠肝癌細胞tk-、tk+細胞對GCV敏感性檢測決定采用的GCV濃度建立大鼠肝癌細胞tk/GCV系統(tǒng)技術路線第62頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二大鼠肝癌細胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+對GCV敏感性（MTT法，72h）第63頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+不同混合比例對tk/GCV系統(tǒng)旁觀者效應的影響(MTT法）

組別tk+細胞比例（％）存活率（%）GCV15.7μM10％98.2±5.525％92.6±10.9310％71.0±9.0

a420％57.3±5.2

b540％48.8±7.0

b660％31.0±3.5

b25.9±4.6

b7100％aP0.05,bP0.01,與組1比較第64頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二(一)六味地黃丸藥物血清聯(lián)合不同比例tk/GCV系統(tǒng)對大鼠肝癌細胞的作用觀察第65頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二血清（%）GCVGCV5%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

對照對照對照含藥含藥含藥

Q值057.5100.00±15.2469.70±15.1263.60±1.71122.04±5.99109.67±11.8594.78±6.86128.79±11.91109.53±9.7169.87±28.12

a128.06±0.90105.47±7.7190.51±9.85

120.06±9.2793.58±4.9656.86±13.71

a1.191.12

(mean±SDn=3)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith5%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTT

assay)(Serum:12h)

第66頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二血清（%）GCVGCV10%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

對照對照對照含藥含藥含藥

Q值057.5100.00±15.63c

85.59±6.37ac72.40±8.48b

89.06±12.85c73.46+±12.55c76.40±16.17b

91.06±9.69c84.58±6.25c55.97±13.06abd

97.45±12.60c91.88±8.34cb

75.16±11.99b

92.77±11.11c87.89±1.87db

57.79±8.45bd1.231.73

(mean±SDn=6)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith10%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTTassay)(Serum:12h)

第67頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二10%tk/GCV，7.5%對照血清孵育12h10%tk/GCV，7.5%含藥血清孵育12h第68頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二血清（%）GCVGCV10%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

對照對照對照含藥含藥含藥

Q值057.5100.00±6.2883.50±9.3569.57±8.78

77.13±3.1772.93±7.9471.98±3.11

a

113.66±4.1984.15±9.5774.80±16.66

a

94.07±10.0868.84±8.8866.31±11.61

a

90.47±3.1779.88±10.0966.53±17.79

a1.041.26

(mean±SDn=3)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith10%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTTassay)（Serum:24h）

第69頁，共76頁，2023年，2月20日，星期二血清（%）GCVGCV20%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

對照對照對照含藥含藥含藥

Q值057.5100.00±1.3073.10±7.9360.95±11.83

67.26±4.5064.54±4.0146.89±3.84

83.29±8.8970.45±9.1441.93±4.54a81.73±6.9676.56±6.3658.15±5.87

96.40±4.9281.01±3.9064.65±8.43

1.020.82

(mean±SDn=3)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith20%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTT

assay)(Serum:12h)