/產(chǎn)品注冊(cè)號(hào)：執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：YZB/京05５３－2003DＹＣ系列電泳槽DYCZ—2４E型電泳槽使用說(shuō)明書(shū)北京市六一儀器廠特別提示:感謝使用本產(chǎn)品，請(qǐng)認(rèn)真閱讀《使用說(shuō)明書(shū)》。《使用說(shuō)明書(shū)》應(yīng)與產(chǎn)品放在一起，以便操作者隨時(shí)閱讀,一旦丟失,請(qǐng)向我們索取。用途及適用范圍本產(chǎn)品與電泳儀組成電泳裝置，用于生化分析研究中對(duì)荷電顆粒進(jìn)行分離、提純或制備。廣泛用于各種凝膠電泳，如丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠和瓊脂糖凝膠等。主要結(jié)構(gòu)產(chǎn)品主要由裝有鉑金絲電極及冷卻裝置的本體、透明槽體、具有限位功能的上蓋、專用制膠槽、玻璃膠室、斜插板等組成；附帶有用于制膠加樣用的試樣格、電泳導(dǎo)線、密封膠條等。規(guī)格與性能電泳槽膠板實(shí)際面積：130ｍm×10０mm?？杉訕悠窋?shù)為1２、16兩種規(guī)格?？捎迷嚇痈窈穸葹?．0mm、1．５mm兩種規(guī)格。槽體采用透明進(jìn)口聚碳酸脂注射成型，美觀、耐用、無(wú)泄漏，防止化學(xué)污染。便于實(shí)驗(yàn)中觀察。材料具有高抗拉強(qiáng)度、耐化學(xué)腐蝕、耐壓、耐高溫特性。本體內(nèi)置的熱交換器通過(guò)兩端接口與循環(huán)水浴連接，電泳時(shí)可在１℃～4５℃進(jìn)行電泳。采用專用制膠槽制膠,一次可制兩塊膠，簡(jiǎn)便快捷?？赏瑫r(shí)跑兩塊凝膠.方便可靠的斜楔夾緊機(jī)構(gòu),保證裝夾膠室便捷和緩沖液室無(wú)泄漏。限位功能保證電極安裝正確,開(kāi)蓋斷電,保證安全。電泳槽可連續(xù)工作時(shí)間≥24h。電極采用耐電解腐蝕、耐高溫、純度≥99．95%的貴金屬鉑制造,具有良好的導(dǎo)電性，并且便于清洗、維修和更換。正常工作條件為:環(huán)境溫度0℃～40℃；相對(duì)濕度≤8０%;周圍無(wú)強(qiáng)烈振動(dòng);實(shí)驗(yàn)臺(tái)應(yīng)平整。開(kāi)蓋斷電，保證安全。允許使用外接電源最大電壓為１０00Ｖ.外形尺寸：（L×W×Ｈ)1７0mｍ×120mｍ×１90mm。緩沖液總體積：約1200mｌ。重量：約2。２ｋg。使用說(shuō)明四．１。SDS電泳試劑配制四．1．1．4xLowerｇeｌbuｆｆｅｒｐH８．81.5MTriｓ90.83g１0%(w／v)SDS20mｌｄdH20到5０0ml用濃ＨcL調(diào)pH至8。8四。１.2.４xUppｅrgelbufferpH6.80．5MTris1２.1１g10％（w/ｖ）SＤS8ｍlddＨ2。到20０ml用濃HCL調(diào)pH至６．８10％SＤＳ：10ｇSＤS溶于１0０ＭＬ蒸餾水中，微波爐加熱,液體呈透明狀。凝固后，每次使用前加熱溶解后使用。四．1.3.30%Acrｙlaiｎｉdeｒegular2９。2％(w/v)aｃｒylaｍide29．2g0。８%（w／v）Bis-acrｙlamide0.8gdｄＨ2Otｏ10０ml微波爐加熱使ａcrylamｉde完全溶解,冷卻后加Ｂis?；旌先芙夂蠖ㄈ荩b棕入色瓶。四.1。４.10xRunｎingbｕfｆer０．25ＭTris3０．3g1。９２MGly144。1g1.0％（w/v)SDSl0．0gｄdH2Ｏto1０00ml(無(wú)需調(diào)pH)ｐH即為8．2-—8.３四.２.樣品緩沖液配制試劑名稱成分含量/濃度配置方法2倍樣品０．５ＭTris—Hcl,PＨ6.8２.0ml以上溶液混合后加雙蒸餾水2.５ml至10ml，可適當(dāng)調(diào)整溴酚藍(lán)的用量以保證電泳時(shí)的最佳指示。緩沖液丙三醇（甘油)２．０ml20％SＤＳ2.0mｌ0．１％(ｗｌv）溴酚藍(lán)0。5mｌ2－ｂ巰基乙醇1．０ml四。３。分離膠、濃縮膠分離膠ddH２0ｍl4×loｗｅrml３０%Acｒｍl１０0％TＥMEDul1０％ＡPul5％7３210ul1０0ul7%６。２32。８10ul100uｌ10%53410ｕｌ100uｌ1１。５0％4。434．６10uｌ100ul１2％4.２34.810ｕｌ100ul13。50%3。63５.410ul100ul1４％３.4３５。６10ul100uｌ15％３３610ul１00ｕl濃縮膠dｄH2０ml4Xuppｅrｍl30%Ａｃrml100％TＥMEDul10%APul5%4．06１.68１5ul5０ｕl四。4．聚丙烯酰胺凝膠孔徑的選擇凝膠孔徑大小與濃度和交聯(lián)度的關(guān)系如下。決定凝膠孔徑大小的主要因素是單體丙烯酰胺的濃度，如7。５％的凝膠平均孔徑為5nm;3０％的凝膠平均孔徑為2nm。但交聯(lián)劑也有一定的影響，如Bis:Aｃｒ由1：１5變到1：60時(shí)會(huì)使乳酸脫氫酶的Rf值由0．１４8升到0。２73。凝膠濃度與被分離物質(zhì)分子質(zhì)量大小的關(guān)系如表所示。適用凝膠濃度樣品樣品分子量范圍／Dａ適用凝膠濃度%蛋白質(zhì)或其他生物分子小于1萬(wàn)20－－301——４萬(wàn)15-—20４－—10萬(wàn)１0－—１５10－—50萬(wàn)5--1０大于50萬(wàn)2—－5樣品分子量范圍／Kb適用凝膠濃度%核酸﹤4萬(wàn)１5—-2０RＮA1－—１０萬(wàn)5——1０10—-200萬(wàn)２—－２。6四.5。凝膠濃度計(jì)算四.5.1．假定膠濃度定為10%,２４Ｄ每一玻板所用膠總量為10ml,２8A每一玻板所用膠總量為２0ml（見(jiàn)附后分離膠配方）求30%的Aｃr的用量為多少？Xｍlx3０%＝10ｍlx10%X＝３。3mｌ四．５．２．配方時(shí)，如果Acr的ml數(shù)計(jì)算出來(lái),上或下Trisbuffer一般都是4倍的，總體積假如是1０ｍｌ除4倍=2.5mｌ。確定了Ａcｒ和上、下Tｒisｂufｆer的用量后，最后用蒸餾水調(diào)到總體積。TEＭED和過(guò)硫酸銨因用量極微,不計(jì)入總體積。四．5.３．濃縮膠用膠濃度５%,總體積一般5mｌ。實(shí)驗(yàn)操作流程指南聚丙烯酰胺俗稱“電泳分子篩”，具有很高的分辨率.此外，這種技術(shù)設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量小、時(shí)間短、操作方便、可分離物質(zhì)分子大小范圍廣泛（從多肽到核糖核蛋白體及病毒都可分離).如選用有效的檢測(cè)方法(如銀染法、同位素自顯影)還可進(jìn)行超微量檢測(cè)；并可結(jié)合SＤS以測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量；結(jié)合孔梯度進(jìn)行自然蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定；加入載體兩性電解質(zhì)可進(jìn)行凝膠電聚焦;還可進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移分析及雙向電泳等。五。1.將接觸膠面的2塊玻板用紗布沾著酒精順著一個(gè)方向擦，晾干,戴手套操作。五.2。安裝模具。一次性塑料滴管順著凹邊的一側(cè)灌分離膠，待分離膠距凹槽頂部２cm處停止,立即加1-2cm的蒸餾水壓上,作用是隔氧和去氣泡.可放冰箱下層加速凝膠速度。五．３.待分離膠凝固后，灌濃縮膠至凹槽頂部,立即將梳子插入?？煞疟湎聦蛹铀倌z速度。五。4．將要測(cè)定的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)化,這是能否作好電泳的關(guān)鍵步驟.五。４．1。在樣品和緩沖液100度煮之前，要對(duì)每一個(gè)樣品的蛋白濃度稀釋或濃縮為１ｍg/1ml，否則樣品的蛋白濃度過(guò)高，在煮時(shí)煮不開(kāi)，不能充分裂解為單體，電泳效果不好?？梢詼?zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，也可用UＶ280和蛋白染料法快速標(biāo)定蛋白濃度。五。４．2。蛋白染料：沒(méi)和蛋白結(jié)合前，染料呈黃褐色,和蛋白結(jié)合后,染料呈藍(lán)色,蛋白濃度越高，染料顏色越藍(lán).五．4.3。將0.０２５g考馬斯亮蘭Ｇ250溶在1２．5ml無(wú)水乙醇中,加2５ml(８5%）磷酸加蒸餾水定容至2５0ｍl。五。4．3.稱1ｍg標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶在１mｌ水中,制成１mg/1ｍl標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。50ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白+1mｌ蛋白染料５0ml待測(cè)樣品+1ｍｌ蛋白染料對(duì)著標(biāo)準(zhǔn)蛋白管1ｍg/１ml，調(diào)整樣品管的顏色。五。5．樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白mａｒk按著1:1的體積加樣品緩沖液,放在100度的沸水中煮3分鐘,注意把離心管扎個(gè)眼或用封口膜緊緊纏繞幾圈，防止煮崩了.五.6．濃縮膠凝固后，將玻璃反轉(zhuǎn),凹玻璃沖里，．向上槽和下槽分別灌緩沖液.五.7．在緩沖液的襯托下,開(kāi)始拔梳子。五。８．上樣，每個(gè)樣孔１5－２0ul樣品.五。9.待電泳的指示劑跑到槽的底部后,停止電泳。將2塊玻板拿出,用一個(gè)很薄的刀片，輕輕的插進(jìn)凹槽玻璃的頂部與另一塊玻璃之間的縫隙，用薄刀片輕輕向上撬，將上層玻璃輕輕撬開(kāi)。五。１0。用刀片從2側(cè)沿著剝板劃開(kāi)，或不劃開(kāi),帶著玻璃染色，脫色.將劃開(kāi)的玻璃反轉(zhuǎn)，有膠面朝著染色液，用薄刀片輕輕在膠面頂部劃開(kāi)１小口子,用一次性吸管順著劃開(kāi)的小口不斷滴加染色液,膠自動(dòng)從玻板剝離下來(lái),落進(jìn)染色盆中。五。1１。染色液配置五。１１。1。固定:將蛋白固定住，條帶清晰，顏色深.50%的無(wú)水乙醇７％冰醋酸五.１1.2.考馬斯亮蘭R2500.４g溶在５０ml無(wú)水乙醇中,充分溶解，攪拌。加１0ml乙酸，蒸餾水40ml。先把染料放在一個(gè)燒杯里配，一定充分把顆粒溶掉，靜止后，倒進(jìn)染料盆里,不溶的染料顆粒留在燒杯里。染色時(shí)間一個(gè)小時(shí)。五．12．脫色將染色后的膠片放到脫色液中脫色，開(kāi)始時(shí)，多換幾次。以后，可以多放脫色液,過(guò)夜?？捎昧坏拿撋珦u床過(guò)夜脫色，直至膠片背景蘭色成完全透明狀。普通脫色:需脫色2天。7５mｌ冰醋酸，8７５ml蒸餾水，5０ｍｌ甲醇快速脫色：12小時(shí)就可脫完。25%無(wú)水乙醇，10％冰醋酸五.13.電泳條件五。13。1。按2個(gè)玻板垂直之間的距離,每cｍ大約10-12伏電壓,恒壓。五．13.2.如果24F室溫下建議200-25０伏，電泳時(shí)間5-6小時(shí)五．13.3。建議電泳槽接低溫循環(huán)器后,電壓可增加到400－500伏.電泳時(shí)間為2.５-3小時(shí)五.13.4。如果緩沖液提前過(guò)夜置冷,電壓３00－４00伏，電泳時(shí)間3。５—４.５小時(shí)以上電泳時(shí)間參考的是7。5%的凝膠濃度,如果凝膠濃度大于10%以上時(shí),電泳時(shí)間隨著濃度增加越高，時(shí)間延長(zhǎng)相應(yīng)也更多.五．14。蛋白銀染銀染色的第一步是固定。固定有兩個(gè)目的：一是將蛋白固定在凝膠中或至少是防止蛋白在凝膠中擴(kuò)散.第二個(gè)目的是去除干擾染色的物質(zhì),如去污劑，還原劑和緩沖液的一些組分,如甘氨酸。固定液可以是甲醛，乙醇（甲醇)和醋酸或三氯醋酸.固定后的凝膠才能由銀顆粒顯色。對(duì)SDS電泳的凝膠進(jìn)行銀染色,一定要在染色前去除SDS，所以通常要用幾次漂洗的程序。Kirｋeby等提出應(yīng)該用縮短固定時(shí)間來(lái)加速銀染色的程序。最佳固定應(yīng)該是時(shí)間短，不會(huì)在染色時(shí)產(chǎn)生背景，能有效的固定蛋白，不影響蛋白與染色劑的反應(yīng)，并且固定液的濃度應(yīng)盡可能的低。他們用乙醇,醛和酸溶液預(yù)固定１0分鐘，然后用極低濃度的甲醛和戊二醛的乙醇溶液或甲醛(或戊二醛)的苦味酸和乙醇溶液僅僅固定5分鐘，便可加速靈敏的銀染程序.步驟試劑時(shí)間————-————--—————————-——-—-———————--固定500ml乙醇至少3０分鐘1０0ml冰醋酸4０0ml蒸餾水浸泡75ml乙醇30分鐘17g醋酸鈉1。25ml25％戊二醛(新鮮配制)0。5g硫代硫酸鈉。5Ｈ2O（需要事先置冷）用蒸餾水溶解后加至２50ml漂洗用蒸餾水漂洗三次5分鐘/次銀染0。25g硝酸銀20分鐘５０ul甲醛(新鮮配制)用蒸餾水加至250ｍl水洗這一步驟時(shí)間短，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)背景變花，用玻璃板在水里沾一下就拿出來(lái)顯色６．25g碳酸鈉（事先置冷）2－－10分鐘視蛋白帶顯２5uｌ甲醛（新鮮配制)示深棕色用蒸餾水加至2５0mｌ終止3。65gEDTA-Nａ２。2H2O10分鐘用蒸餾水加至250ml漂洗用蒸餾水漂洗三次5分鐘/次保存25mｌ８7%甘油３0分鐘取出晾干用蒸餾水加至2５0mｌ以上各步驟各自準(zhǔn)備一個(gè)脫色、染色槽，不能混用。多肽的銀染由于分子小很難固定，文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為較好的固定劑是1２。５%戊二醛。等電聚焦凝膠配制DYCＺ—２4Ｅ垂直電泳槽帶冷卻水循環(huán)裝置，接上低溫循環(huán)器,在上下兩槽分別放上陰極,陽(yáng)極緩沖液后，常常被研究人員用來(lái)選做垂直板的等電聚焦。（一）高壓等電聚焦聚焦電泳原理在等電聚焦中，分離是在連續(xù)的、穩(wěn)定和線性的pH梯度中進(jìn)行的。如果把蛋白質(zhì)A和B的混合物放在ｐH3.5-－1０的梯度中，蛋白質(zhì)Ａ將有凈電荷-2,蛋白質(zhì)B將有凈電荷＋2。加上電場(chǎng)后，它們分別向不同的方向遷移.A向陽(yáng)極,B向陰極。在遷移過(guò)程中，蛋白質(zhì)Ａ將進(jìn)入越低的pＨ范圍,并將逐漸損失它的負(fù)電荷，當(dāng)它達(dá)到pH是5的梯度位置時(shí)，它的凈電荷為零，即停止遷移，這就是它的ｐH位置。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)B將向越來(lái)越高的pH范圍遷移，,直到到達(dá)它的凈電荷是零的pH梯度位置，這就是蛋白質(zhì)B的等電點(diǎn)位置。凝膠貯液的配制：凝膠濃度與交聯(lián)度T＝５％Ｃ=3％T=7．5%Ｃ=3％單體貯液(ml)２。５3.7540％載體兩性電解質(zhì)（mｌ）0。９0.9雙蒸水（ml）１１.５1０．25(將上述溶液置于抽濾瓶中抽氣5-——１0分鐘）10％過(guò)硫酸銨（uｌ）7575ＴEMEＤ（ul）88(溶液體積視凝膠大小按比例增減，載體兩性電解質(zhì)的量按凝膠厚薄適量減增。過(guò)硫酸銨TEＭED的量視聚合情況增減。 T=５％、Ｃ=3％的凝膠適合于分析分子量小于３0萬(wàn)的樣品,Ｔ=７.5％,C=3％的凝膠適合于分析分子量小于10萬(wàn)的樣品.）丙烯酰胺單體貯液：

溶解14.５5ｇ丙烯酰胺和0.45ｇＮ,N`—甲叉雙丙烯酰胺在35ml蒸餾水中攪拌,直至溶解.或直接用蒸餾水加至5０mｌ，用微波爐加熱溶解。溶液在4℃中保存數(shù)月。加樣方法：?如用考瑪斯亮藍(lán)R25０染色時(shí)，對(duì)0。5mm厚的凝膠，樣品濃度以0．5－—2ug/uｌ為宜,最適合的加樣體積為5——２0ul(5mｍ×10mm加樣塊）.如果樣品較濃，可直接在凝膠上滴加1－-３ul樣品；如果樣品較稀，可用一個(gè)塑料小筐盛液或用一小塊泡沫塑料吸取樣品。通?？蓪悠芳釉诩訕訛V紙上，可減少拖尾現(xiàn)象。如用銀染色法檢測(cè),可將加樣量減少20-50倍.電極溶液。

PH范圍3.5-９.52.5—4.5４.5—6．55．0—8．0

陽(yáng)極0。５mol/Ｌ醋酸０．5mｏl/Ｌ醋酸0。5mol/L醋酸0．04mol/L-谷氨酸?陰極0。5ｍｏl/L０.4mｏl/L0．5mol/L0。5mol/L

氫氧化鈉HＥPES氫氧化鈉氫氧化鈉

ＰH范圍陽(yáng)極陰極

3.5—9。51mol/Ｌ磷酸1mol／L氫氧化鈉?2。5—4.5１mol/L磷酸Ｏ.4mol/LHＥPＥS

4。0—6。50.5mol/L醋酸0.５moｌ/L氫氧化鈉?5．0—8．00.5mol/L醋酸0.5mol/L氫氧化鈉?2。5—4.01moｌ/L磷酸2%載體兩性電解質(zhì)pH6～8?3．5—5.21mol／L磷酸2％載體兩性電解質(zhì)pH５～7?4。5—71mｏl/L磷酸1mｏl/Ｌ氫氧化鈉

５。5-７。７２％載體兩性電解質(zhì)ｐH４～６1mol/L氫氧化鈉?6-8。５2%載體兩性電解質(zhì)pＨ4~61mol/L氫氧化鈉

７。8—10２％載體兩性電解質(zhì)pH4~６１ｍｏl／L氫氧化鈉樣品的處理:如血清、血漿、尿、腦脊液、精液、汗、淚、羊水、水痘液等，應(yīng)盡可能使用新鮮體液。如需收集，樣品應(yīng)保存在—2０℃～～-70℃,且保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。血清和血漿可以直接溶解在解聚緩沖液中.。所有樣品必須先透析,再濃縮,或用脫鹽柱脫鹽.腦脊液可先兌10%聚乙二醇透析，再濃縮四倍，加樣１５ul。尿液在進(jìn)一步處理前應(yīng)離心15分鐘。蛋白濃度較低、鹽濃度較高的體液會(huì)干擾等電聚焦。等電聚焦是所有電泳實(shí)驗(yàn)中難度較高的實(shí)驗(yàn)。主要是配膠和樣品提取的過(guò)程中,要盡可能去鹽、去離子。鹽和離子越低，電壓就上得越高,而且不燒膠。通常配膠過(guò)程中要用（鹽)過(guò)硫酸胺，膠凝結(jié)后，在蒸餾水中浸泡1０-—2０分鐘，去掉過(guò)硫酸胺,再加樣品。樣品的準(zhǔn)備和加樣:可溶蛋白的樣品，如體液，細(xì)胞和組織和萃取物能直接用于雙向電泳，但應(yīng)稀釋到合適的濃度。固體樣品,如組織、細(xì)胞或在組織培養(yǎng)液中的細(xì)胞,加樣前應(yīng)先粉碎和溶解。通常使用的溶解液是Ｏ`Ｆarｒｅｌl提出的9mol/L尿素和2％(w/v)非離子去污劑（Np—40或Tｒiton100)。但對(duì)有些蛋白如組織蛋白,核糖體蛋白和膜蛋白的溶解仍然是困難的，必須作合適的處理。載體兩性電解質(zhì)和ｐH梯度范圍的選擇:載體兩性電解質(zhì)是等電聚焦最關(guān)鍵的試劑,常用的濃度為2％～２.5%。2%用于2mm厚膠，2。5％用于0．５mm厚膠，３%用于超薄膠.要選擇質(zhì)量好的載體兩性電解質(zhì)。載體兩性電解質(zhì)的濃度為4０%，應(yīng)在4℃保存.使用時(shí)只需打開(kāi)中心小面積鋁蓋，用注射器穿過(guò)橡皮蓋抽取溶液,切勿用移液管，以便延長(zhǎng)保存期.等電聚焦專用（進(jìn)口)硅酸纖維濾紙,可抗高溫5０0度,對(duì)緩沖液有很強(qiáng)的吸咐，能有效保證高壓時(shí)濾紙不干,抗高溫不燒焦。(二）低壓等電聚焦等點(diǎn)聚焦（低電壓３00—400伏，不需高壓,不需低溫循環(huán)器)的配方。高電壓不需加尿素,低電壓需加尿素。１.儲(chǔ)存液１)．溶液A：30%(W/V）丙烯酰胺．１%（W／Ｖ）雙甲叉.－—丙烯酰胺2）．2０％ＴrｉｔonX—1０0.3）.10％TCA(三氯乙酸）4).1％ＴCA5）。1%溴酚藍(lán)6）．考馬斯亮藍(lán)染色液７）.考馬斯亮藍(lán)脫色液2．灌膠(比例）1）。H２O５。4ml2)．溶液A２。0mｌ3）．載體兩性電解質(zhì)溶液ＰH3.5-1０48ul4）．載體兩性電解質(zhì)溶液PH4—6240ｕl5)．超純尿素(30~４0oC溶解，不能過(guò)高）６。0ｇ6).10%過(guò)硫酸銨２5uｌ7）．TEMED20ｕｌ３．變性凝膠上樣緩沖液1）.2.4g尿素８mmol/Ｌ2).20ul?載體兩性電解質(zhì)PH３。5-1０３）.１00ｕｌ?載體兩性電解質(zhì)PＨ４-6４）．500ul20％ＴritonX—１00５）．5０uｌ?2－巰基乙醇（１％）6).1．7ml雙蒸水7)．２00ul１%溴酚藍(lán)４.電泳液１）．上槽中加陰極電泳液（20mmoｌＮaOH）２）。下槽中加陽(yáng)極電泳液（10mｍolH3PO4)注意：陽(yáng)極電泳液應(yīng)由１mmｏl／LH3PO4儲(chǔ)存液新鮮配制陰極電泳液應(yīng)由1mｍoｌ／LNａOH儲(chǔ)存液新鮮配制應(yīng)在室溫下操作，以防尿素沉淀．5。操作與步驟１）．將蛋白質(zhì)樣品與等體積上樣緩沖液混合，1００0０xg離心,５ｍiｎ以去除蛋白質(zhì)沉淀．2）。用微量注射器將蛋白質(zhì)樣品加入上樣孔底部。６．等電聚焦電泳條件１）.恒壓１５０V電泳３0—６0mｉｎ.２)．恒壓２00－４00V電泳2.5h。開(kāi)始電流應(yīng)為10mA左右,電流下降至恒定為止.既可以結(jié)束。7。聚焦后處理１)．測(cè)PＨ梯度．①將一凝膠條切成0.5cｍ或１cｍ小片．②將每小片凝膠在１ｍl10mMKCL中浸30mｉn.③測(cè)讀此KCL溶液PＨ值。六一市場(chǎng)部提供等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)試劑，也可根據(jù)等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算待測(cè)樣品的PH值。六一凝膠成像儀分析軟件可自動(dòng)分析等電點(diǎn)PH。8.凝膠的染色和脫色.①將凝膠于10%TＣＡ中浸泡10min.②換成1%ＴＣＡ溶液繼續(xù)浸泡至少1h—－2h以去除載體兩性電解質(zhì)．浸泡過(guò)夜可更好地降低考馬斯亮藍(lán)對(duì)載體兩性電解質(zhì)的染色．３).染色脫色①將凝膠于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1０mｉn，并輕輕搖。②倒掉染色液并更換為脫色液，更換脫色液數(shù)次，脫色過(guò)夜．3.考馬斯亮蘭Ｒ２500.4g溶在50ml無(wú)水乙醇中,充分溶解,攪拌．加10mｌ乙酸，蒸餾水40ｍｌ。先把染料放在一個(gè)燒杯里配,一定充分把顆粒溶掉，靜止后,倒進(jìn)染料盆里，不溶的染料顆粒留在燒杯里。染色時(shí)間一個(gè)小時(shí).４．將染色后的膠片放到脫色液中脫色,開(kāi)始時(shí)，多換幾次,以后，可以，多放脫色液過(guò)夜，可用六一的脫色搖床過(guò)夜脫色，直至膠片背景蘭色成完全透明狀。普通脫色:需脫色2天75ml冰醋酸，875mｌ蒸餾水,50ml甲醇快速脫色：1２小時(shí)就可脫完２5％無(wú)水乙醇，10％冰醋酸9.電壓設(shè)置上樣前,預(yù)電泳1００V，20—３０分鐘，讓凝膠中的小分子離子向兩側(cè)泳動(dòng).如何選擇合適的電壓選擇好合適的試劑、濾紙并做成凝膠后，不加樣品空白跑一板電泳。逐漸加壓,直加到燒膠為止的電壓，下降10０伏為合適的電壓。如果試劑一批和一批不同，試劑變了,離子濃度變了，得重新摸索電壓條件。特別注意：做好電泳實(shí)驗(yàn)，試劑質(zhì)量的好壞是很關(guān)鍵的因素.一些外地客戶常常因購(gòu)買假試劑或劣質(zhì)試劑，而影響了電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果,常常重復(fù)很多次做不出結(jié)果。為此,六一市場(chǎng)部提供了質(zhì)量保證、價(jià)格合理的配套電泳試劑，兩性電解質(zhì),耐高溫的進(jìn)口濾紙、3ＭM轉(zhuǎn)移濾紙和轉(zhuǎn)移膜,電泳專用超細(xì)加樣Ｔip頭和其它電泳輔助設(shè)備。電泳儀參數(shù)設(shè)定操作方法七．１．穩(wěn)定電壓首先將電壓的準(zhǔn)確數(shù)值輸進(jìn)去,其它電流或功率值要高于正常工作值,否則電壓不能恒定。例如：恒定電壓為2０0V預(yù)設(shè)電流(100mA,工作電流＋３0mA)，通常1Ｖ電壓≈0。35mA工作電流，２0０Ｖ電壓預(yù)計(jì)工作電流為70mＡ,電流再向上加３0mA,等于100ｍA。預(yù)設(shè)功率值(20Ｗ）:用電壓值除以10倍即２０0V÷10≈2０W實(shí)際工作電功率＝工作電壓(Ｖ）×工作電流（Ａ）2０0V×0。03Ａ=6W七。2。穩(wěn)定電流首先將電流的準(zhǔn)確數(shù)值輸進(jìn)去，其它電壓或功率值要高于正常工作值，否則電流不能恒定。例如：恒定電流為2０ｍA時(shí)預(yù)計(jì)電壓（1０0V，工作電壓+30Ｖ)通常１ｍA≈3。5V工作電壓，2０mA電流預(yù)計(jì)工作電壓為70V,電壓再向上加30V—100V.預(yù)計(jì)電功率值(10Ｗ）:用電壓值除以10倍即１００V÷10＝１0W實(shí)際工作電功率=工作電壓（V)×工作電流(A）０。０2Ａ×７0V=1.4W七．３．恒定功率首先將功率的準(zhǔn)確數(shù)字輸進(jìn)去，其它電壓電流值要高于正常工作值，否則功率不能恒定.例如：恒功率10W—30W時(shí)電流150mＡ電壓10００V４0Ｗ以上時(shí)電流200ｍA（或設(shè)最高值400mA）電壓1500V設(shè)定好各項(xiàng)恒定值后，一按啟動(dòng)鍵,實(shí)際電流,電壓,電功率值顯示出來(lái)，黑色光標(biāo)閃爍處為恒定的數(shù)值。如果你需要恒定的值沒(méi)有黑色光標(biāo)閃爍，說(shuō)明沒(méi)有恒定住,可將另1或另2項(xiàng)輔助值適當(dāng)升高一點(diǎn)，直至恒定值能出現(xiàn)黑色光標(biāo)閃爍。五型電泳儀恒壓之前,先要把電流的