———外泌體的物理表征方法及其衍生物miRNA的應(yīng)用

近期市場(chǎng)研究報(bào)告預(yù)測(cè)到2030年全球外泌體研究市場(chǎng)規(guī)模和份額需求將達(dá)到18.96億美元，說(shuō)明外泌體具有巨大的市場(chǎng)潛力和行業(yè)認(rèn)可度。由于外泌體的體積較小一般為(30100nm)，所以外泌體的準(zhǔn)確定量和表征在技術(shù)上是具有挑戰(zhàn)性的人。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)并應(yīng)用了許多技術(shù)來(lái)克服這些挑戰(zhàn)。納米粒子跟蹤分析(NanoSight)技術(shù)就是用于外泌體大小和定量主要方法之一。比如：NanocoulterⅠ納米粒度儀采用了新一代電學(xué)原理可以同時(shí)進(jìn)行納米粒子或外泌體的單顆粒檢測(cè)，顆粒粒徑大小測(cè)量、濃度測(cè)定、zeta電位標(biāo)定、形態(tài)多維度檢測(cè)等廣泛用于外泌體的分離和純化過(guò)程中。

外泌體的物理表征方法

常用的外泌體物理表征方法是基于顯微鏡的方法，例如透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、低溫電子顯微鏡和原子力顯微鏡；動(dòng)態(tài)光散射；納米粒子跟蹤分析；可調(diào)電阻脈沖傳感；和單個(gè)EV分析等。

用于分析外泌體濃度、定量和概況的分子生物方法主要包括：實(shí)時(shí)定量PCR、數(shù)字PCR技術(shù)（基于芯片的dPCR、液滴數(shù)字PCR、ddPCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡、全基因組測(cè)序（next-generationsequencing）、exome-targetedsequencing（下一代測(cè)序）、微陣列圖譜技術(shù)和ELISA技術(shù)等。

外泌體衍生物miRNA的重要應(yīng)用

miRNA的靈敏生物標(biāo)志物測(cè)定法主要用于檢測(cè)早期階段(0-1)腫瘤的存在。除了基于組織活檢的當(dāng)前研究外，循環(huán)miRNA的研究是生物標(biāo)志物研究中一個(gè)新的擴(kuò)展領(lǐng)域，因?yàn)樗鼈兙哂兴刑卣鳎╩iRNA分析、診斷、預(yù)后、治療反應(yīng)和預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物），可在液體活檢（生物體液）中檢測(cè)到,并且不需要對(duì)病人進(jìn)行健康和腫瘤活檢。血液樣本等體液分析檢測(cè)使醫(yī)生和研究人員能夠及早了解癌癥的發(fā)展?fàn)顩r。

miRNA被稱(chēng)為基因表達(dá)的基本調(diào)節(jié)因子，尤其是在癌癥中，并且在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和對(duì)各種療法的耐藥性中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，哺乳動(dòng)物細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞含有大約100,000個(gè)內(nèi)源性miRNA分子。據(jù)估計(jì)，單個(gè)外泌體最多可攜帶約500個(gè)miRNA拷貝。正常人血液中的外泌體量在癌癥患者中約為109個(gè)外泌體/ml。

miRNA是一類(lèi)主要的小分子、單鏈、非編碼RNA分子，其成熟形式的長(zhǎng)度在20到22個(gè)核苷酸(NT)之間，在幾乎所有生物途徑中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、免疫反應(yīng)，細(xì)胞凋亡，代謝和腫瘤發(fā)生。

外泌體在體液中的主要作用是可以保護(hù)miRNA，防止其生物分子在非生理?xiàng)l件下（多次凍融循環(huán)、長(zhǎng)期儲(chǔ)存和極端pH）降解。據(jù)報(bào)道，外泌體來(lái)源的miRNA在-20C下可保持穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)5年，并且對(duì)凍融循環(huán)具有抵抗力.這也使外泌體成為癌癥和其他疾病的潛在生物標(biāo)志物。miRNA與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并且還被證明被遠(yuǎn)端或附近的受體細(xì)胞吸收作為外泌體中的貨物，作為細(xì)胞間通訊的一種方法，可能會(huì)影響發(fā)病機(jī)制。所以，外泌體可以被看作是miRNA轉(zhuǎn)移至目標(biāo)受體細(xì)胞的載體。外泌體保護(hù)miRNA免于降解，使它們比游離miRNA更穩(wěn)定，并能被特定受體細(xì)胞有效整合。因此，在外泌體攜帶的貨物中，miRNA可以提供有關(guān)它們來(lái)源的細(xì)胞類(lèi)型、靶標(biāo)和細(xì)胞狀態(tài)的身份信息。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體已成為通過(guò)傳遞癌miRNA促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤微環(huán)境重塑的主要候選者。血管生成對(duì)于惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，因?yàn)樾卵芸梢蕴峁╊~外的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以清除廢物。比如：癌細(xì)胞釋放外泌體exo-miR-21、exo-miR-23；外-miR-29；exo-miR-103和exo-miR-210可以促進(jìn)增殖、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。

如今，雖然已在各種細(xì)胞類(lèi)型釋放的外泌體中找到2838種miRNA。但是還是需要進(jìn)一步的研究來(lái)更好地了解外泌體miRNA作為生物標(biāo)志物在癌癥中的作用。

增強(qiáng)的外泌體純化有利于下游分析，包括更準(zhǔn)確的囊泡定量和表征。蘇州阿爾法生物提