試驗一顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀看一、試驗?zāi)康囊匀旧Ｆ瑸槔?，嫻熟把握顯微鏡油鏡的使用方法。二、試驗原理1顯微鏡油鏡使用的原理光學(xué)局部:接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大,造成物象〔2〕機械局部:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)2顯微鏡的放大倍數(shù)和區(qū)分率〔1〕放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)顯微鏡的區(qū)分率：表示顯微鏡辨析物體〔兩端〕兩點之間距離的力氣，可用公式表示為：D=λ/2n·sin(α/2)式中D：物鏡區(qū)分出物體兩點間的最短距離。λ：可見光的波長〔0.55μm〕n:物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。a：鏡口角〔即入射角。3〔其折射率與玻片的相近三、試驗材料1精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。2枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的玻片染色標(biāo)本。四、試驗方法與步驟用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。調(diào)整光亮度。低倍鏡觀看：先粗調(diào)再微調(diào)至物象清楚。轉(zhuǎn)入中倍、高倍觀看，每一不只需調(diào)微調(diào)旋紐即可看到清楚的物象。，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。繪出所觀看到的細(xì)菌形態(tài)圖像。、換片：另換片觀看，必需從〔3〕步開頭操作。、用后復(fù)原：觀看完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去油鏡頭上的香柏油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油。五、試驗報告油鏡使用的原理繪制細(xì)菌形態(tài)六、思考題油鏡與一般物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別留意些什么？使用油鏡時，為什么必需用鏡頭油？七、試驗留意事項不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光滑度。觀看標(biāo)本時，必需依次用低、中、高倍鏡，最終用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不行使用粗調(diào)整器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。觀看時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀看的習(xí)慣，以免眼睛疲乏，并且能夠在左眼觀看時，右眼注視繪圖。拿顯微鏡時，確定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不行單手拿，更不行傾斜拿。顯微鏡應(yīng)存放在陰涼枯燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。八、教學(xué)反響一、試驗?zāi)康膵故彀盐诊@微鏡油鏡的使用方法。學(xué)習(xí)染色的根本技術(shù)，二、試驗原理簡潔染色的原理鮮亮比照。三、試驗材料1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。212-18h3、簡潔染色液〔美藍(lán)染色液、黑色素液或炭素墨水〕四、試驗方法與步驟1、活菌制片觀看取一張干凈的載玻片，在其中心滴上一滴干凈的蒸餾水，取培育12-18h的枯草芽孢桿油鏡的使用步驟，觀看草芽孢桿菌形態(tài)，邊觀看邊繪圖。2、簡潔染色涂片:取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中心，用無菌操作分別〔每一種菌制一片留意滴生理鹽水時不宜過多，涂片必需均勻。枯燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。2—3染色：在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色１分鐘。水洗：傾去染液，用自來水細(xì)流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。枯燥：空氣中自然枯燥或在酒精燈高處微微加熱。鏡檢：在油鏡下觀看細(xì)菌形態(tài)。五、試驗報告油鏡使用的原理繪制細(xì)菌形態(tài)六、思考題鏡檢標(biāo)本時，為什么先用低倍鏡觀看，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀看？依據(jù)試驗體會，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時，應(yīng)留意哪些事項？七、教學(xué)反響試驗三細(xì)菌的革蘭氏染色一、試驗?zāi)康陌盐崭锾m氏染色。了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、試驗原理1革蘭氏染色的原理革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要有肽聚糖形成的網(wǎng)狀構(gòu)造組成，在染色過程中，當(dāng)用95%乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀構(gòu)造中的孔徑變小，細(xì)胞壁的通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保存在細(xì)胞壁內(nèi)而不易脫色脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物簡潔被乙醇抽提出來而脫色，然后又被染上了復(fù)染劑的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。三、試驗材料24h24h革蘭氏染色液〔結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸復(fù)紅〕載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。四、試驗方法和步驟1附表2微生物染色常用染料A酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。B堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。C中性〔復(fù)合〕Wright染料和Gimsa染料等〔常用于細(xì)胞核染色D〔Sudanb〕的染料2涂片。初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用配的盧哥氏碘液沖去殘水，而后用其掩蓋涂面1分鐘，后水洗。9530秒，后馬上用流水沖洗。復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：觀看染色結(jié)果。五、試驗報告1革蘭氏染色的根本原理和意義2革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵六、思考題依據(jù)試驗體會，你認(rèn)為制備染色標(biāo)本時，應(yīng)留意哪些事項？制片為什么要完全枯燥后才能用油鏡觀看？做革蘭氏染色涂片為什么不能過于深厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？七、教學(xué)反響一、試驗?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)和把握配制培育基的一般方法和步驟學(xué)會試驗室滅菌鍋的使用方法二、試驗材料牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4.·7H2O。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布。滅菌鍋三、試驗方法(一)牛肉膏蛋白胨培育基的配制牛肉膏蛋白胨培育基是一種應(yīng)用最廣泛和最一般的細(xì)菌根底培育基。其配方如下：3g10g．NaCl5g15-20g1000mL，pH7.4-7.6。稱藥品：按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在。加熱溶解：在燒杯中參與少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并溢出，最終補足所失的水分。pH：檢測培育基的pH，假設(shè)pH11mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pHpH1mol/LHClpHpH離子的濃度。過濾：液體培育基可用濾紙過濾，固體培育基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀看。分裝：按試驗要求，可將配制的培育基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗以免培育基沾在管口或瓶口上面造成污染。分裝量：固體培育基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積一半為宜。半固體培育基以試管高度的1/4為宜，滅菌后垂直待凝。3／5要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。包扎：加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水紙。然后用記號筆注明培育基名稱、組別、日期。121.3℃濕熱滅菌20min。如因特別狀況不能準(zhǔn)時滅菌，則應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫存。擺斜面：滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，使斜度的長度不超過試管總長度的1/2。無菌檢查：將滅菌的培育基放入37℃溫箱中培育24-48h，無菌生長即可使用?；騼Υ嬗诒淝鍧嵉臋粌?nèi)，備用。四、試驗結(jié)果和報告記錄本試驗配制培育第的名稱、數(shù)量，并圖講解明其配制過程，指明要點。五、問題和思考配制培育基有哪幾個步驟?在操作過程中應(yīng)留意些什么問題?為什么?培育基配制完成后，為什么必需馬上滅菌?假設(shè)不能準(zhǔn)時滅菌應(yīng)如何處理？如何進(jìn)展無菌檢查，試設(shè)計試驗對飲料進(jìn)展無菌檢查。六、演示培育基的分裝方法。試管斜面的擱置方法七、留意事項稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)準(zhǔn)時蓋緊瓶蓋。調(diào)PH時要留神操作，避開回調(diào)。不同培育基各有配制特點，要留意具體操作。八、教學(xué)反響一、試驗?zāi)康暮蛢?nèi)容學(xué)習(xí)從上壤中分別微生物的方法，學(xué)習(xí)無菌操作技術(shù)。用稀釋法分別細(xì)菌、放線茵和霉菌。用平板劃線法分別微生物。學(xué)習(xí)平板接種等無菌操作技術(shù)。二、試驗材料金黃色葡萄球菌和一般變形菌斜面菌種。1112套、無菌EP101000ul200ul20ul1000ul200ul槍頭、20ul無菌水(49.5mL、帶玻璃珠)180％乳酸、10％酚液、95％乙醇。三、試驗方法(一)土壤稀釋分別5-10ml處的土樣．放入滅菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。制備稀釋液0.5g5-10min,10-2的土壤懸液。梯度稀釋：用移液器吸10-2100ul，放入裝有900ul無菌水的EP10-3的稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3-10-8的稀釋液。留意：每一個稀釋度換用一支槍頭。(二)平板劃線分別微生物倒平板：按無菌操作要求，在火焰旁操作，取溶化并冷卻至不燙手的固體培育基(約50℃)，倒入無菌培育皿中，倒量以鋪滿皿底為限，平放桌上待其充分凝固，備用。劃線分別：使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分別的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應(yīng)培育基平板中劃線分別，劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落。培育：方法同“土壤稀釋分別”(三)平板接種培育10-7、10-8、10-9重復(fù)，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-91ml10-9310-8稀釋液各lml10-8310-7lml10-73〔由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換。945—5022-2)，輕輕轉(zhuǎn)動平板，使菌液與培育基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培育。至長出菌落后即可計數(shù)?；蟪脽岬谷霟o菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上〔每個編號設(shè)三個重復(fù)。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻〔圖22-，每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培育基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培育，至長出菌落后即可計數(shù)。四、試驗結(jié)果和報告1記錄土壤稀釋分別結(jié)果，并計算出每克土壤中的細(xì)菌、放線曲和霉菌的數(shù)量。30-300總個數(shù)／g＝同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)x稀釋倍數(shù)2五、問題和思考在測定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法?試設(shè)計試驗，從土壤中分別出酵母菌，并進(jìn)展計數(shù)。試設(shè)計試驗，從水或者空氣中分別微生物，并進(jìn)展計數(shù)。六、留意事項一般土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤中分別細(xì)菌時，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計數(shù)。在土壤稀釋分別操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計數(shù)準(zhǔn)確。放線菌的培育時間較長，故制平板的培育基用量可適當(dāng)增多。六、教學(xué)反響一、試驗?zāi)康?1)了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測定原理和測定意義。(2)學(xué)習(xí)和把握用稀釋平板計數(shù)法測定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。(3)學(xué)習(xí)和把握水中大腸菌群的檢測方法。二、試驗原理水是微生物廣泛分布的自然環(huán)境。各種自然水中常含有確定數(shù)量的微生物。水中微來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動物的傳染性排泄物。水的微生物學(xué)的檢驗，特別是腸道細(xì)菌的檢驗，在保證飲水安全和把握傳染病上有3mL1001mL1g數(shù)法，由于計算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit，cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。37℃24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。100mL(MPN)表示。在正常狀況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可隨人畜排泄物進(jìn)入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對飲用水必需進(jìn)展大腸菌群的檢查。的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡潔、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于堵塞濾孔的水樣。多管發(fā)酵法包括初(步)發(fā)酵試驗、平板分別和復(fù)發(fā)酵試驗三個局部。1、初(步)發(fā)酵試驗：培育基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培育基即由原來的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽孢細(xì)菌生長的作用。水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37℃下培育，24小時內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培育基混濁，能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說明是陰性結(jié)果，在少量的狀況下，也可能延遲到48小時后才產(chǎn)氣，此時應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此，以上兩種結(jié)果均需連續(xù)做下面兩局部試驗，才能確定是否是大腸菌群。482、平板分別：〔遠(yuǎn)藤氏培育基，Endo’smedium〕或尹紅美藍(lán)瓊脂(eosinmethyleneblueagar,EMBagar),前者含有堿性復(fù)紅染料，在此作為指示劑，24483、復(fù)發(fā)酵試驗：一步證明。原理與初發(fā)酵試驗一樣，經(jīng)24小時培育產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最終確定為大腸菌群陽性結(jié)果。三、試驗器材菌落總數(shù)的測定：培育基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培育基，無菌生理鹽水。器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。大腸菌群的測定；1有倒置小套管)，尹紅美藍(lán)瓊脂平板；、材料：無菌水、載玻片、滅菌帶玻璃塞空瓶、無菌吸管、無菌試管等。四、試驗方法水樣的采集：自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。5m10-15cm先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。假設(shè)不能在2h細(xì)菌總數(shù)的測定：1)水樣稀釋及培育：10⑦依據(jù)對水樣污染狀況的估量2-3一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水—被選擇1:100、1:1000、1:100001mL345℃15mL，并趁熱轉(zhuǎn)動平皿混合均勻。④待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37℃24±1h后取出，計算平皿內(nèi)菌1mL計算方法：作平板計數(shù)時，可用肉眼觀看，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在登記各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。計數(shù)的報告：①平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)中菌落分布又很均勻，可計算半個平板后乘2②稀釋度的選擇：30-30011)。30-30022，則報告其中較小的數(shù)字(l2、例3)。c．假設(shè)全部稀釋度的平均菌落均大于300，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(l4)。假設(shè)全部稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(15)。假設(shè)全部稀釋度均無菌落生長，則以小于1〔16)。假設(shè)全部稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-30030300落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報告之(表l7)。③細(xì)菌總數(shù)的報告：細(xì)菌的菌落數(shù)在l00以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個數(shù)，可用101“報告方式”一欄所示。大腸菌群的測定(多管發(fā)酵法)：(一)自來水檢查：1、初(步)發(fā)酵試驗在250ml100ml105ml10ml372424482、平板分別經(jīng)2448線接種于尹紅美藍(lán)瓊脂平板上，再于37℃下培育18-24小時，將符合以下特征的菌落的一小局部，進(jìn)展涂片，革蘭氏染色，鏡檢。⑴深紫黑色、有金屬光澤。⑵紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；⑶淡紫紅色、中心顏色較深。3、復(fù)發(fā)酵試驗經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌1-3372410ml300ml(100ml210ml1010ml100ml水量陽性管數(shù)0每升水樣中大腸菌群數(shù)1每升水樣中大腸菌群數(shù)2每升水樣中大腸菌群數(shù)0<3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230〔二、池水、河水或湖水等的檢查：110-110-2。21ml10-2、10-11ml10ml10ml100ml5ml50ml白胨發(fā)酵管(瓶)中。3、以下步驟同自來水的平板分別和復(fù)發(fā)酵試驗。4、將100、10、1、0.1(10-1)ml10、1、0.1(10-1)、