微生物實驗指導(dǎo)實驗一微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌培養(yǎng)基是將微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的各種營養(yǎng)基質(zhì)。它具有微生物正常生活所需的各種養(yǎng)料和適宜的環(huán)境條件：(1)適當(dāng)組分和比例的營養(yǎng)物質(zhì)；(2)適宜的pH值；(3)合適的滲透壓；(4)保持無菌狀態(tài)。所以培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物所必需的最主要材料。培養(yǎng)基的配制是微生物工作者的主要技術(shù)操作之一。一、實驗?zāi)康呐c耍求：1．了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。2．了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。3．熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作及操作方法。二、實驗原理與材料：(一)培養(yǎng)基的種類根據(jù)培養(yǎng)基的組成成分，可將培養(yǎng)基分為三類：合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。半合成培養(yǎng)基：由一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成的。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分：液體培養(yǎng)基：不加凝固劑。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加2％左右的凝固劑。半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2％一0.5％凝固劑。微生物最常用的凝固劑為瓊脂(其次為明膠)，又叫洋菜、凍粉。它不是一種營養(yǎng)物質(zhì)，只能被極少數(shù)種類的細(xì)菌分解利用。瓊脂是從海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一種多糖類化合物，主要成分是復(fù)雜的多糖硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規(guī)濃度下加熱到96℃以上即成溶膠狀態(tài)，融化的瓊脂，當(dāng)溫度下降到42表3-1瓊脂與明膠特性比較比較項目瓊脂明膠比較項目瓊脂明膠熔點(℃)凝固點(℃)酸堿度灰分(％)氧化鈣(％)氯化鎂(％)氮(％)9640微酸16.01.15O.77O.402520酸性14.0—15.00.00.018.3微生物可利用性耐熱性來源化學(xué)本質(zhì)常用濃度（％)絕大多數(shù)微生物不能水解利用強植物多糖1.5—2部分微生物能水解利用弱動物蛋白質(zhì)5一12（二）實驗材料1．藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂；馬鈴薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KN03，MgS04·7H20、FeSO4·7H20、等。2．高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細(xì)菌過濾器、紫外線殺菌。3．其它：天平、牛角匙、電爐、1NHCl、1NNaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無菌試管、無棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、吸管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標(biāo)簽等。三、實驗方法與步驟：(一)、培養(yǎng)基的配置1．培養(yǎng)基的配制常用方法和步驟：(1)稱量：按照培養(yǎng)基配方，正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。(2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根據(jù)實驗需要加入蒸餾水或自來水)，用玻棒攪勻，加熱溶解。(3)調(diào)pH值(調(diào)pH也可以在加瓊脂后再調(diào))，用1NNaOH或1NHCl調(diào)pH，用pH試紙對照。(4)加瓊脂熔化，在瓊脂熔化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全熔化后，補足所失水分，一般數(shù)量少，時間短不必補水。(5)分裝：在漏斗架上分裝。根據(jù)不同的需要進行分裝，一般制斜面的裝量為管高的五分之一。特別注意不要使培養(yǎng)基粘污在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。(6)包扎成捆、掛上標(biāo)簽。培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，用防水紙包扎成捆，掛上所配培養(yǎng)基名稱的標(biāo)簽。(7)滅菌備用。滅菌后如需制成斜面的，應(yīng)在下磅后取出，擺成斜面，(見圖3一1)。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃2．三種培養(yǎng)基的配方及配制（1）.牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(用于分離和培養(yǎng)細(xì)菌，是一種天然培養(yǎng)基)。配方：牛肉膏3克蛋白胨5克氯化鈉3克瓊脂20克自來水1000毫升pH7．2～7．4滅菌15磅／英寸2，30分鐘。本實驗將原配方配成各種濃縮液。各種濃度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨，30％氯化鈉。以配制200毫升培養(yǎng)基為例：吸取30％牛肉膏2毫升，50％蛋白胨2毫升，30％氯化鈉2毫升，加入有刻度的搪瓷燒杯中，然后用自來水補足到200毫升。用玻捧攪勻，在電爐上稍加熱，調(diào)pH至7.4，加瓊脂4克，加熱熔化，用玻棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解為止，趁熱在漏斗架上裝試管，(見圖3—2)。裝帶有棉塞的無菌試管，裝置五分之一的試管高度共12支，作斜面培養(yǎng)基。用鋁殼試管帽的各裝10毫升，約試管高度的二分之一以上，用作分離時倒平板用。分裝完畢，以12支為一捆，用防水紙包扎成捆，(圖3—3)掛上標(biāo)簽，滅菌備用。（2）．馬鈴薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)瓊脂培養(yǎng)基。(用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基)。配方：去皮馬鈴薯(或鮮豆芽)200克蔗糖(或葡萄糖)20克自來水1000毫升瓊脂20克pH自然滅菌：(含蔗糖)15磅／英寸230分鐘。(含葡萄糖)10磅／英寸220分鐘。制備方法：配制200毫升培養(yǎng)基。取去皮馬鈴薯40克，切成小塊，放入無刻度的搪瓷杯中，加水200毫升，置電爐上加熱，煮沸十分鐘，用四層紗布過濾至具刻度的搪瓷杯中，濾液加水補足至200毫升，然后加蔗糖4克，加瓊脂4克，加熱熔化，并用玻棒不斷攪拌，直至瓊脂完全熔化，分裝試管，下面一系例步驟同配細(xì)菌培養(yǎng)基相同。（3）淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏一號Gause’S1)，用于分離和培養(yǎng)放線菌之用，是一種合成培養(yǎng)基。配方：可溶性淀粉20.O克KN031.0克K2HP04O.5克MgS04·7H20O.5克NaClO.5克FeS04·7H20，O.01克瓊脂20克自來水1000毫升滅菌：15磅／英寸2，30分鐘。制備方法：配制200毫升培養(yǎng)基吸取配方液：1％KN0320毫升；l％K2HP04lO毫升；l％MgSO4·7H2OlO毫升；l％NaCl10毫升；1％FeSO4·7H2OO.2毫升，加水補足至200毫升，置電爐上加熱。用另一只搪瓷杯稱取可溶性淀粉4克，從200毫升中取出少量加入淀粉中，用玻棒調(diào)成糊狀，待液體沸騰后，將淀粉糊洗入培養(yǎng)液中，攪勻，取下調(diào)pH至7.4，加瓊脂4克，加熱至瓊脂完全熔化為止，趁熱分裝試管，下面一系例步驟同于配制細(xì)菌培養(yǎng)基的操作方法。（4）．無菌水的制備：無菌水，為下一次微生物分離實驗中所需用的材料。100毫升三角瓶(裝有玻璃珠)，裝自來水45毫升，試管中裝9毫升自來水，塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角瓶和試管須預(yù)先塞好棉塞，并經(jīng)干熱滅菌。(二)分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準(zhǔn)備1．清洗一些玻璃儀器：如三角瓶，試管，培養(yǎng)皿、吸管等。2．棉塞的制作：裝培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用為過濾空氣，使試管內(nèi)外空氣可以流通，但外界空氣中雜菌不能進入，避免污染。試管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口約l～2毫米處，用解剖針塞入少許棉花，(約1—1.5厘米長)，以防止細(xì)菌吸入口中，并避免將口中細(xì)菌吹入管內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜。吹時以能通氣但不使棉花滑下為準(zhǔn)。教師示范做試管棉塞，同學(xué)每人做5支試管棉塞。棉塞要求不緊不松，兩頭光滑，試管棉塞的長度約3厘米左右。塞入試管內(nèi)部分約占2／3，頭部稍大約占l/3左右，見圖3—4。12345.圖3-4棉塞的要求條件1.正確的式樣2.管內(nèi)部太短，管外太松3.管外太小4.整個棉塞過松5.管內(nèi)部太緊，管外太松3．包裝培養(yǎng)皿和吸管等。為了使培養(yǎng)皿、吸管，三角玻棒等洗凈，干熱滅菌后，不讓表面暴露，以保證無菌狀態(tài)，為此干熱滅菌前先用舊報紙包裝妥當(dāng)(見示范)，每組同學(xué)包培養(yǎng)皿6只(一包)。吸管的包裝，將塞好棉花的吸管尖端，放在4～5厘米寬的長紙條的一端，約成45o角，折疊紙條，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。見圖3—5。(三)培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法滅菌的方法，通?？梢苑譃樗拇箢悾?1)加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、干熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；(2)過濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；(4)化學(xué)藥劑滅菌和消毒。在本實驗中，以介紹與培養(yǎng)基和玻璃器材滅菌有關(guān)的部份滅菌方法。1．干熱滅菌法(即熱空氣滅菌法)：干熱滅菌—般是利用電熱烘箱作為干熱滅菌器。前面所包裝好的玻璃器皿，如帶棉塞的三角瓶，試管、包裝好的吸管、培養(yǎng)皿等蛋白質(zhì)含水量(%)凝固溫度(℃)5025186O5674—8080—90145160一170，放入電熱烘箱中。打開烘箱頂部的通氣孔，接上電源加熱，使箱內(nèi)空氣的溫度達(dá)到160℃一170℃，關(guān)閉通氣孔，使箱內(nèi)的溫度保持在160℃左右，并維持1.5—2．加壓蒸汽滅菌法利用高壓滅菌器，使水的沸點在密閉的滅菌器內(nèi)隨壓力升高而增高(見表3—2)，來提高蒸汽的溫度和滅菌的效率。表3-2加壓蒸汽滅菌器壓力數(shù)與蒸汽溫度間的關(guān)系壓力表所示壓力全部水蒸汽(無空氣)50％空氣全部空氣磅／英寸2公斤／厘米25101520O.350.71.051.4l108115121126941051121187290100109在同一溫度下，濕熱的殺菌效率比干熱大，因為微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)在濕熱情況下，易于凝固，(見表6—2)。同時濕熱的穿透力強，當(dāng)水蒸汽與被滅菌的物品相接觸后，便放出汽化潛熱，逐步提高被滅菌物品的溫度，直至與水蒸汽的溫度相等，達(dá)到平衡為止,從而提高滅菌效率。手提式高壓滅菌鍋滅菌的操作步驟如下：(1)在滅菌器內(nèi)加入一定量的水(有的滅菌器內(nèi)加水至止水線)。將用防水紙包扎好的滅菌物品如:培養(yǎng)基、無菌水等，放進滅菌器內(nèi)。(2)接通電源，進行加熱。(3)當(dāng)壓力到達(dá)5磅／英寸2時，打開放氣閥，使鍋內(nèi)的空氣和水蒸汽一同排出，直至壓力表的壓力恢復(fù)到零，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱。(4)當(dāng)壓力表上的壓力到達(dá)15磅／英寸2(即1.05公斤／平方厘米)時，此時滅菌器內(nèi)的溫度達(dá)到121℃(5)滅菌時間一到，切斷電源，待壓力下降至零時，才能打開排氣孔，然后打開滅菌器蓋，取出物品。如果滅菌后的固體培養(yǎng)基要做成斜面,需趁熱放置。還需檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。3．間歇滅菌法：常采用阿諾(Arnold)氏滅菌器和柯赫(Koch)氏滅菌器或蒸籠滅菌，常壓條件下，蒸汽溫度不超過100度。在沒有高壓滅菌器設(shè)備的情況下或不宜加壓滅菌的物品，可采用此法滅菌。做法是：待滅菌物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮一次，每次煮沸一小時，連續(xù)三天重復(fù)進行。在每兩次蒸煮之間，將物品(指培養(yǎng)基)放在37℃4．過濾除菌法：一些不能加熱滅菌的液體物質(zhì)(如維生素、血清)，可以用過濾除菌法，一般用細(xì)菌過濾器進行除菌。(教師示范)細(xì)菌過濾器中的過濾板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，過濾板孔眼很小，細(xì)菌不能通去。因此，過濾后的液體就除去了細(xì)菌。在進行過濾除菌前，整個細(xì)菌過濾器和接受液體的器皿，必須包裝妥當(dāng)進行加壓蒸汽滅菌后方可使用。5．紫外線滅菌：波長2600一2800A(A=1／10nm)之間的紫外線有很強的殺菌能力，一般紫外燈管能產(chǎn)生2537A的紫外光，殺死力強而穩(wěn)定，但穿透力弱，一般只適宜物體表面、空氣滅菌。例如接種室、培養(yǎng)室、手術(shù)室、藥廠包裝室等空氣滅菌。一般30瓦燈管，9立方米空間，距地面2米，每次打開紫外線照射半小時，就使室內(nèi)空氣滅菌。若照射紫外線時，先噴灑石碳酸等化學(xué)消毒劑，可增強滅菌效果。在進行微生物接種和分離等操作時，常須用紫外線來殺滅接種室(箱)空氣、臺面等處的微生物。(參觀示范)紫外線雖有較強的殺菌力，但穿透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。表3—4常用化學(xué)抑茵劑和殺毒劑類別代表常用濃度作用方式用途及用法醇類乙醇70—75％抑制細(xì)菌使蛋白質(zhì)凝固變性皮膚和器皿消毒對芽孢\孢子無效醛類甲醛37—40％2毫升／米3與蛋白質(zhì)胺基結(jié)合使其變性接中寶、接中箱熏蒸，殺死空氣中微生物酚類石炭酸來蘇兒5％2—5％破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)變性接中室空氣及器皿消毒空氣及皮膚消毒重金屬離子升汞O.1％細(xì)菌細(xì)胞酶失活而中毒死亡植物組織，如根瘤的消毒(有劇毒)氧化劑高錳酸鉀漂白粉0.1—3％1一5％蛋白質(zhì)及酶氧化變性水果、皮膚、器皿消毒飲水及糞便消毒表面活性劑肥皂新潔爾滅水稀20倍破壞細(xì)胞膜的滲透壓皮膚、手及器血的消毒鹵素碘l％碘酒蛋白質(zhì)、酶受破壞皮膚消毒染料結(jié)晶紫2—4％水溶液抑制細(xì)胞壁的合成作用皮膚創(chuàng)傷消毒酸類乳酸食醋80％乳酸l毫升／米33—5毫升／米3與細(xì)胞原生質(zhì)結(jié)合熏蒸消毒空氣，可預(yù)防流感病毒堿類石灰水3—5％水溶液破環(huán)酶的活性地面消毒紫外線對眼粘膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用，所以不能直接在紫外線燈開啟下工作。6．化學(xué)藥劑消毒滅菌：微生物實驗室中常用的化學(xué)殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑。具體見表6—4。四、實驗注意事項使用高壓蒸汽鍋時應(yīng)加充足水分，以免蒸干。鍋內(nèi)的冷空氣要排盡，否則壓力雖達(dá)要求，而溫度未達(dá)到要求，滅菌不完全。每次使用干熱滅菌箱時，要滅菌的玻璃器皿，必須完全干燥，以免引起玻璃的破裂。調(diào)節(jié)溫度不能高于180℃，否則會使棉花、紙張烤焦。滅菌后，需等溫度下降到l60在使用過濾器前應(yīng)檢查過濾器有無裂隙及漏氣，濾器用后應(yīng)立即清洗。五、實驗記錄六、實驗數(shù)據(jù)處理七、思考題配制培養(yǎng)基為什么要調(diào)節(jié)pH值？培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么?配固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時要注意那些問題?為什么牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基不加礦物鹽類？配制培養(yǎng)基要注意哪些問題？可否用橡皮塞、木塞來代替棉花塞？干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌應(yīng)用的的場合有何不同?如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底?I．環(huán)境中的微生物因為微生物是肉眼看不見的，所以初學(xué)微生物學(xué)的學(xué)生常不知道外界環(huán)境和所有與外界接觸的身體各部位均有微生物的存在。實際上它們廣泛分布于室內(nèi)外的空氣、水和土壤中，桌、椅和板凳的表面，衣服以及身體的皮膚、粘膜（例如鼻腔、口腔、喉頭等的粘膜）等處，因此，可以說微生物是無縫不鉆，無孔不入的。在學(xué)生第一次進入微生物學(xué)實驗室時，建立起“微生物無所不在”這一概念是特別重要的，因為這樣才能體會到無菌技術(shù)和環(huán)境衛(wèi)生的必要性，才能防止外界微生物對培養(yǎng)物的污染，才能防止病原性細(xì)菌或病毒通過手或衣服進入人體而引起傳染。從周圍環(huán)境和體表各部取樣生長出來的微生物，雖然大多數(shù)屬正常菌群，但當(dāng)進入破損的皮膚或傳入口內(nèi)或眼睛等處也會引起傳染，這一方面是因為通過培養(yǎng)，微生物的量大；另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但當(dāng)條件改變時也可能致病（稱為條件致病菌），因此必須詳細(xì)閱讀操作步驟和聽從指導(dǎo)者的說明，特別是用過的棉簽和工作完畢后的培養(yǎng)物等均要放在指定的容器內(nèi)，接種環(huán)不僅在用前必須燒灼滅菌，而且用后也應(yīng)立即燒灼。這是整個微生物學(xué)實驗課程和今后進行微生物學(xué)實驗時均需注意的。下面的實驗就是從實驗室空氣、實驗臺、門的旋扭（或把手）和人的頭發(fā)、皮膚、洗手前后的手指和鼻腔粘膜等處取樣，接種于瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)1—2天后，觀察并比較不同來源的微生物生長的數(shù)量和類型。實驗二實驗室環(huán)境和人體表面微生物的檢查一、目的要求1．證明實驗室環(huán)境與體表存在微生物。2．比較來自不同場所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類型。3．體會無菌操作的重要性。二、基本原理平板培養(yǎng)基含有細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)成分，當(dāng)取自不同來源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在37℃溫度下培養(yǎng)，1—三、器材肉膏蛋白胨瓊脂平板，無菌水，滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈或煤氣燈，記號筆（或蠟筆），廢物缸。四、操作步驟每組在“實驗室”和“人體”兩大部分中各選擇一個內(nèi)容做實驗，或由教師指定分配，最后結(jié)果供全班討論。1．寫標(biāo)簽任何一個實驗，在動手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號，培養(yǎng)皿的記號一般寫在皿底上。如果寫在皿蓋上，同時觀察兩個以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開皿蓋時，容易混淆。用記號筆寫上班級、姓名、日期，本次實驗還要寫上樣品來源（如實驗室空氣或無菌室空氣或頭發(fā)等），字盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。2．實驗室細(xì)菌檢查（1）空氣將一個肉膏蛋白胨瓊脂平板放在當(dāng)時做實驗的實驗室，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無菌室或無人走動的其他實驗室，移去皿蓋。一小時后蓋上兩個皿蓋。（2）實驗臺和門的旋鈕（a）用記號筆在皿底外面中央畫一直線，再在此線中間處畫一垂直線，如圖。（b）取棉簽左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無名指夾持棉塞（或試管帽），將其取出，將管口很快地通過煤氣燈（或酒精燈）的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出。放回棉塞（或試管帽），并將空試管放在試管架上。（c）弄濕棉簽左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞（或試管帽）并燒灼管口，將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管口，放回棉塞（或試管帽），并將滅菌水試管放在試管架上。（d）取樣將濕棉簽在實驗臺面或門旋鈕上擦拭約2平方厘米的范圍。（e）接種在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動一下），立即閉合皿蓋。將原放棉簽的空試管拔出棉塞（或試管帽），燒灼管口，插入用過的棉簽，將試管放回試管架。（f）劃線另取接種環(huán)在火焰上滅菌，先將環(huán)端燒熱，然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來回通過火焰數(shù)次。左手拿起平板，同樣開啟一縫，將滅過菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過瓊脂頂端的接種區(qū)，向下劃線，直到平板的一半處。注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動的壓力不能太大，否則會刺破瓊脂。閉合皿蓋，左手將平板向左轉(zhuǎn)動至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上燒灼，使冷。接種環(huán)通過前面劃的線條再在瓊脂的另一半，從上向下來回劃線至1／2處。燒灼接種環(huán)，轉(zhuǎn)動平板，劃最后1／4，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放回原處。整個劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動作要快。3．人體細(xì)菌的檢查（1）手指（洗手前與洗手后）（a）分別在兩個瓊脂平板上標(biāo)明洗手前與洗手后（當(dāng)然，班級、姓名、日期各項在每次寫標(biāo)簽時是必不可少的）。（b）移去皿蓋，將未洗過的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來回劃線，蓋上皿蓋。（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來回移動，蓋上皿蓋。（2）頭發(fā)在揭開皿蓋的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動數(shù)次，使細(xì)菌降落到瓊脂平板表面，然后蓋上皿蓋。（3）咳嗽將去蓋瓊脂平板放在離口約6—8cm處，對著瓊脂表面用力咳嗽，然后蓋上皿蓋。（4）鼻腔（a）按照實驗臺檢查法的步驟（b）和（c），取出棉簽，并將其弄濕。（b）用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動數(shù)次。（c）按實驗臺檢查法的步驟（e）和（f），接種與劃線，然后蓋上皿蓋。4．將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1—5．結(jié)果記錄方法（1）菌落計數(shù)在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內(nèi)的菌落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。（2）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不同的菌落類型。但要注意，如果細(xì)菌數(shù)量太多，會使很多菌落生長在一起，或者限制了菌落生長而變得很小，因而外觀不典型，故觀察菌落的特點時，要選擇分離得很開的單個菌落。菌落特征描寫方法如下：（a）大小大、中、小、針尖狀?？上葘⒄麄€平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個大小范圍。（b）顏色黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。（c）干濕情況干燥、濕潤、粘稠。（d）形態(tài)圓形、不規(guī)則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。（f）透明程度透明、半透明、不透明。（g）邊緣整齊、不整齊。五、實驗報告1．結(jié)果（1）將你自己的平板結(jié)果記錄于下表中。（2）與其他同學(xué)所做的結(jié)果進行比較。2．思考題（1）比較各種來源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？（2）人多的實驗室與無菌室（或無人走動的實驗室）相比，平板上的菌落數(shù)與菌落類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？（3）洗手前后的手指平板，菌落數(shù)有無區(qū)別？（4）通過本次實驗，在防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴散方面，你學(xué)到些什么？有什么體會？實驗三顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀察微生物的個體微小，肉眼難以見到，要研究它們，必須要用顯微鏡來觀察。因此，顯微鏡是研究微生物的重要工具。顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，使用時必須了解其基本原理和構(gòu)造，才能充分發(fā)揮其性能。一、實驗?zāi)康暮鸵螅?．學(xué)習(xí)并掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù)及維護的基本知識。2．使用油鏡觀察細(xì)菌的幾種基本形態(tài)。3．用懸滴法在高倍鏡或油鏡下觀察細(xì)菌的運動。二、實驗裝置與材料：（一）光學(xué)顯徽鏡1．顯微鏡的構(gòu)造普通光學(xué)顯微鏡可分為兩大部份：光學(xué)部分和機械部分。光學(xué)部分通常是由接目鏡、接物鏡和照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)組成的。它使檢視物放大，造成物象，是顯微鏡的重要組成部份。機械部分由鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件組成，它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。2．顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率(1)顯微鏡的放大倍數(shù)顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過物鏡第一次放大造像，再經(jīng)過目鏡在明視距離內(nèi)第二次放造像。因此，顯微鏡的放大倍數(shù)等于接物鏡放大倍數(shù)和接目鏡放大倍數(shù)的乘積。即：顯微鏡放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)。(2)顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體(兩端)兩點之間距離的能力，能夠辨析物體兩點問的距離愈小，則分辨率愈高，分辨率的高低，首先取決于物鏡的鏡口率所使用光線的波長，見圖(1—2)顯微鏡的分辨率可以用以下公式表示：式中D：為物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。λ：為可見光的波長(平均O.55微米)。n:為物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。α:為鏡口角(即入射角)。λ愈大，D值愈大，分辨率愈低，n和α愈大，D值愈小，分辨率愈高，因此，可以通過降低光線波長，增大介質(zhì)折射率和加大鏡口角(入射角)來提高分辨率。3．油鏡使用的原理：對于個體微小，用高倍鏡仍觀察不清的微生物，則必須使用油鏡。使用時，需要在標(biāo)本和物鏡間加入一種鏡頭油。如香柏油，所以叫油浸接物鏡，簡稱油鏡。一般在鏡頭上有一黑圈或紅圈的，表示為油鏡物鏡，也有的以“OI”或”HI”字樣來表示。由于油鏡鏡面很小，使用時檢視物與鏡面又非?？拷?O.14一O.19毫米左右)，因而使進入鏡頭的光線較少。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭間的空氣時，由于玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣(接物鏡干燥系)，空氣折射率為l，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射現(xiàn)象，結(jié)果進入物鏡的光線必然減少，這樣就降低了視野的照明度。若載玻片與物鏡之間的介質(zhì)不是空氣，而是一層油質(zhì)，一般常用香柏油，其折射率為1.515，與玻璃的折射率(1.52)相近。光線通過載玻片后可直接通過香柏油進入物鏡而幾乎不發(fā)生折射(接物鏡油浸系)，使視野增加照明度，這樣就能使物像更加清晰；(二)、實驗材料1．顯微鏡，(顯微鏡燈)、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。2．細(xì)菌的染色標(biāo)本。3．培養(yǎng)12～18小時的枯草桿菌(B.Subtilis)4．蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。三、實驗方法與步驟(一)顯微鏡的使用方法與步驟1．用前檢查：從顯微鏡箱中取出顯微鏡時，用右手拿鏡臂，左手托鏡座，直立移動，輕放在平穩(wěn)的桌面上，檢查各部零件是否齊全，鏡頭是否清潔，否則報告老師。2．調(diào)節(jié)光照：正確的照明是獲得良好檢查效果的前提。用粗調(diào)節(jié)器提升鏡筒，將低倍物鏡旋到鏡筒下方，使鏡頭和載物臺距離約為5毫米左右，左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度(在天然的光線下觀察，一般用平面反光鏡；若以燈光為光源，則一般多用凹面反光鏡)。調(diào)節(jié)光線強弱，然后調(diào)節(jié)聚光鏡的位置(酌予升降)，直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的光亮為止。3．低倍鏡觀察：低倍物鏡視野面廣，焦點深度較深，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)確定觀察位置，故應(yīng)先用低倍鏡觀察為宜。將載片標(biāo)本(涂面朝上)置于載物臺的標(biāo)本夾上，并將標(biāo)本部位處于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭下降至鏡面距離檢視物大約10毫米處。然后以左眼看目鏡，另一眼睜開，一邊觀察視野，一邊扭動粗調(diào)節(jié)器使鏡頭緩慢地升高，至視野內(nèi)出現(xiàn)物像后，改用細(xì)調(diào)節(jié)器，上下微微轉(zhuǎn)動，仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清晰的物像，選擇適宜部位，移到視野中心，待換中、高倍鏡觀察。4．依次再進行中倍、高倍觀察。在物鏡依次由低倍至中倍、高倍的觀察過程中，應(yīng)逐次上升聚光鏡以調(diào)節(jié)光線亮度，同樣選擇適宜的部位移至視野中央。5．油鏡觀察：將聚光鏡提升至最高點，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，移開高倍鏡，使高倍鏡和油鏡成“八”字形，在標(biāo)本中央滴一小滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，微微轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器，可見清晰物像，如果油鏡上升已離開由面還未看清物像的話，需重新調(diào)節(jié)。此時可從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接。應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不能用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。用右手向上轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，當(dāng)視野中有模糊的標(biāo)本物像時，改用細(xì)調(diào)節(jié)器，直到看清物象為止。6．換片：另換新的標(biāo)本片，必須從第三條開始操作。7．用后復(fù)原：觀察完畢，上旋鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去鏡頭上的殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。機械部件用細(xì)軟布擦去灰塵和冷凝水，下降鏡筒，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形置于載物臺上。下降聚光鏡，(切勿使接物鏡與聚光鏡相碰受損)，反光鏡垂直于鏡座。放進顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的顯微鏡柜中。四、實驗注意事項顯微鏡顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項：(1)不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件，以免損壞。(2)鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布擦，以保證鏡面的光潔度。(3)觀察標(biāo)本時，必須依次用低倍鏡、中倍鏡、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可用粗調(diào)節(jié)器向下旋，以免物鏡碰到玻片損傷鏡面或壓碎玻片。(4)觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，。以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。(5)拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿動。(6)顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片生霉菌而腐蝕鏡片。(7)在轉(zhuǎn)動粗細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)焦距時，要從側(cè)面觀察，切勿使物鏡鏡頭與玻片相碰，以免損壞鏡頭。(8)在觀察細(xì)菌、放線菌的形態(tài)時，由于采用油鏡頭透鏡口徑較小，所以光線要調(diào)到最強，便于觀察。五、實驗記錄六、實驗數(shù)據(jù)處理七、思考題如何區(qū)別顯微鏡的低倍鏡、高倍鏡和油鏡？使用油鏡時，為何必須鏡頭油？鏡檢標(biāo)本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？實驗四顯微鏡直接計數(shù)法一、目的要求1．明確顯微鏡計數(shù)的原理。2．學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。二、基本原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的（0．1mm2），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。血球計數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室，微生物的計數(shù)就在計數(shù)室中進行。。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格（圖Ⅷ-1，C）。但無論是哪種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的，即16×25=400小方格，如圖Ⅷ-2。每一個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0．1mm，所以計數(shù)室的容積為0．1mm3。在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。下面以一個大方格有25個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個大方格中的總菌數(shù)因1ml=1cm3=1000mm3，=50000A·B（個）同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，設(shè)五個中方格的總菌數(shù)為A＇，則三、器材釀酒酵母菌懸液，血球計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)管。四、操作步驟1．稀釋將釀酒酵母菌懸液進行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2．鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數(shù)。3．加樣品將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。4．顯微鏡計數(shù)靜止5分鐘后，將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格（可選4個角和中央的中格）中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時，即作兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的值來計算樣品的含菌量。5．清洗血球計數(shù)板使用完畢后，將血球計數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。五、實驗報告1．結(jié)果將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。2．思考題根據(jù)你實驗的體會，說明用血球計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？微生物送檢標(biāo)本的采集指南微生物送檢標(biāo)本的采集指南微生物學(xué)檢驗標(biāo)本的正確采集、運送及處理，與細(xì)菌的培養(yǎng)。鑒定結(jié)果有十分密切的關(guān)系，對可疑烈性呼吸道傳染?。ㄈ鏢ARS、炭疽、肺鼠疫等）患者采集標(biāo)本時，必須按國家規(guī)范化要求嚴(yán)格注意生物安全；醫(yī)生、護士、檢驗人員均應(yīng)重視微生物學(xué)檢驗標(biāo)本正確采集的有關(guān)問題，并有責(zé)任向患者及其家屬進行正確采集標(biāo)本的宣傳和指導(dǎo)。（一）微生物學(xué)檢驗標(biāo)本采集、運送、驗收和處理注意事項1.標(biāo)本采集1）申請單標(biāo)記必須清楚（姓名、性別、年齡、病例號、臨床診斷、標(biāo)本采集、采集時間、檢查項目、抗生素應(yīng)用情況等），以便實驗室能夠合理選擇培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基；2）盡量在抗生素應(yīng)用前采集標(biāo)本，以提高陽性檢出率和避免漏檢；3）標(biāo)本采集應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作；4）咽拭、肛拭、傷口拭等拭子標(biāo)本，應(yīng)插入運送培養(yǎng)基送檢；5）痰、尿液傷口拭子等混有正常菌群的標(biāo)本，不可放入肉湯培養(yǎng)基內(nèi)送檢；6）采集標(biāo)本的容器必須經(jīng)滅菌處理，但不可用消毒劑。2.標(biāo)本運送1）標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送到微生物實驗室；2）標(biāo)本采集后在室溫下超過2h未送達(dá)實驗室，可視為不合格標(biāo)本。3.標(biāo)本驗收1）實驗室只能接受和處理合格標(biāo)本；2）實驗室對不合格標(biāo)本退回必須說明原因，并應(yīng)及時與臨床聯(lián)系。4.注意事項1）微生物檢驗樣本必須按要求采集轉(zhuǎn)運，否則將影響檢查結(jié)果，并給評價其意義帶來麻煩甚至誤導(dǎo)；2)微生物樣本極易被污染，污染的樣本雜菌大量繁殖抑制病菌生長，條件致病菌也是致病菌，如污染條件致病菌將誤導(dǎo)臨床，造成對患者的損害以及經(jīng)濟和時間的浪費。3)某些標(biāo)本離體極易死亡，應(yīng)在床邊采取和接種或立即保溫送至實驗室檢驗。室溫放置或延遲送檢，可使檢出的陽性率降低，不能使用冷藏的標(biāo)本檢驗。4)厭氧菌樣本采取必須隔絕空氣，混入空氣的樣本影響檢驗結(jié)果，不能使用。（二）微生物學(xué)檢驗標(biāo)本采集和處理1.尿液標(biāo)本采集和處理通常留取晨起第一次尿液（此時尿液在膀胱內(nèi)儲存4h以上）；尿液采集后要及時送檢，并保證2h內(nèi)接種；不能及時送檢和接種時，尿液應(yīng)置4～8度冰箱保存；冷藏標(biāo)本應(yīng)于8h內(nèi)接種；淋球菌培養(yǎng)的標(biāo)本不能冷藏！懷疑沙門氏菌感染時，應(yīng)于發(fā)病2w左右采集尿液，懷疑鉤端螺旋體感染時，應(yīng)于發(fā)病后2w采集尿液，上述世間此時陽性率高。尿液微生物學(xué)檢驗標(biāo)本采集方法如下：（1）中段尿采集法：是臨床上最多采用的方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗外陰及陰道口；男性病人應(yīng)翻轉(zhuǎn)包皮沖洗，用1：1000新潔爾滅消毒尿道口，用無菌紗布擦干，讓病人排尿，棄去前段尿，收集中段尿10—20ml，盛于無菌容器內(nèi)，立即加蓋送檢。（2）導(dǎo)尿法：是一種無菌采集法，主要適用于手術(shù)后患者，取10-15毫升尿液于無菌容器內(nèi)送檢，但留置導(dǎo)尿管易造成醫(yī)院內(nèi)感染。(3）集尿法：尿液檢查結(jié)核分枝桿菌時，可用一潔凈容器，留取24h的尿液，取其沉淀部分200-250毫升盛于清潔瓶內(nèi)送檢。（4)恥骨上膀胱穿刺法：將病人恥骨上皮膚消毒后，以無菌針筒作膀胱穿刺。此法主要用于尿液中厭氧菌的培養(yǎng)，故在取得尿液后，針頭插于橡皮塞上送檢。當(dāng)兒童或嬰兒采集中段尿困難或培養(yǎng)結(jié)果與患者病情有矛盾時，可考慮用此法采集尿液。（5）腎盂尿采集法：為確定菌尿是否來自腎臟，可用導(dǎo)尿管采集腎盂尿。首先充分沖洗膀胱，以最后一次沖洗尿作對照，后用導(dǎo)尿管插入輸尿管，分別標(biāo)記左右側(cè)，收集3次尿；如果輸尿管菌數(shù)比對照尿菌數(shù)多或第3次尿中菌數(shù)比第1次多，該菌尿可能來自腎臟。反之，如果第1次尿菌數(shù)多于第3次尿菌數(shù)，則可能來自膀胱。腎盂尿采集法一般應(yīng)該請泌尿科醫(yī)師協(xié)助進行，并確實做好標(biāo)記，以防左右側(cè)搞錯。糞便標(biāo)本采集和處理采集時間：腹瀉患者于急性期，盡量在用藥前采集糞便：傷寒患者于發(fā)病2w以后采集糞便；懷疑霍亂時立即采集糞便送檢。采集方法:自然排便法：取新鮮糞便的粘液、膿血、或絮狀物等有意義成分，2-3g或1-2ml，盛無菌容器內(nèi)或置于保存液或增菌液內(nèi)送檢；若疑似霍亂者應(yīng)置于堿性蛋白胨水中（PH:8.6)。直腸拭子法：難以獲得糞便或排便困難患者及幼兒可采用此法，將拭子前端用無菌甘油或生理鹽水潤濕，然后插入肛門約4-5cm（幼兒2-3cm），輕輕在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)。擦取直腸表面粘液后取出，盛于無菌試管中或保存液中送檢。痰及下呼吸道標(biāo)本采集和處理自然咳痰法：①晨痰為佳；②先冷開水洗漱、清潔、口腔和牙齒；③再用力咳出呼吸道深部的痰，吐至無菌容器中；④痰量不得少于1ml；⑤痰咳出困難時可先霧化吸入NaCl溶液（100g/L，加溫到45℃）使痰容易咳出。查結(jié)核分枝桿菌，應(yīng)留取24小時痰。小兒取痰法：用彎壓舌板向后壓舌，將拭子深入咽部，小兒因壓舌板刺激引起咳嗽，噴出的肺或氣管分泌物粘在拭子上即可送檢。支氣管鏡、支氣管穿刺、支氣管肺泡灌洗等采集法，此采集法必須由醫(yī)生操作。氣管導(dǎo)管法：用氣管插管吸取下呼吸道痰液。氣管鏡采集法：用氣管鏡在肺內(nèi)病灶附近用導(dǎo)管吸取或用支氣管刷直接取得。呼吸道標(biāo)本采集方法：鼻咽拭子法，先用清水漱口，對光坐，頭向上仰，口張大，用壓舌板輕壓舌根，用棉拭子在病人咽后壁，懸雍垂后側(cè)涂抹數(shù)次，立即放入無菌試管中。注意事項：痰經(jīng)過口腔，所以患者應(yīng)用清水漱口數(shù)次，盡量排除口腔內(nèi)大量雜菌。痰液標(biāo)本要求涂片鏡檢：達(dá)到低倍鏡視野中≤10個鱗狀上皮細(xì)胞，以及≥25個白細(xì)胞方可送檢。血液及骨髓培養(yǎng)標(biāo)本血培養(yǎng)標(biāo)本采集指征：對入院的危重患者未進行系統(tǒng)性抗生素治療前，應(yīng)及時進行血液培養(yǎng)，患者出現(xiàn)以下體征可作為血培養(yǎng)的重要指征：發(fā)熱（≥38℃）或低熱（≤36℃）寒熱白細(xì)胞增多(>10×109/L，特別是在有“核左移”未成熟的或帶狀的白細(xì)胞增多時)粒細(xì)胞減少(成熟的多核白細(xì)胞<1×109/L)血小板減少皮膚黏膜出血昏迷多器官衰竭最常用的方法為血液增菌培養(yǎng)法。培養(yǎng)瓶分為需氧瓶和厭氧瓶兩種。每瓶需要8-10ml。兒童瓶為需氧瓶每瓶需血液1～3ml。另外，腦脊液和胸腹水也可用血液增菌培養(yǎng)瓶，但僅需要兒童瓶，標(biāo)本量與血液相同。①抗生素治療前，嚴(yán)格無菌靜脈采血8～10ml(兒童1～4ml)；不同時間或不同部位采取2-3份血液標(biāo)本；②無菌注入專用培養(yǎng)瓶(成人、兒童、需氧菌、厭氧菌、L型菌需要不同培養(yǎng)瓶)中送檢；③如已用抗生素不能停用時，可于48h內(nèi)分別于下次用抗生素之前，采用不同時間的3份血液標(biāo)本送檢；④必要時可需氧菌、厭氧菌﹙占10％﹚和L型菌同時培養(yǎng)； ⑤疑為心內(nèi)膜炎時，為提高陽性檢出率，可酌情不同部位、不同時間，多次采血或動脈采血進行培養(yǎng)； ⑥必要時可取骨髓1～2ml,無菌注入專用培養(yǎng)瓶中送檢。 注意事項：血液在正常情況下為無菌標(biāo)本，應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作，避免雜菌污染。一般病人在發(fā)病初期1～2天或發(fā)熱高峰時采集血液標(biāo)本，用一次性注射器在肘靜脈采血，采血前局部皮膚應(yīng)徹底消毒。對亞急性細(xì)菌心內(nèi)膜炎等病人，應(yīng)從肘動脈或股動脈采血為宜。 5、腦脊液 1）采集時間：懷疑腦膜炎時應(yīng)立即采集腦脊液，最好是在應(yīng)用抗生素之前采集腦脊液。 2）采集方法：無菌腰穿采集腦脊液3～5ml分裝到3個無菌小瓶中(各1～2ml)。用于細(xì)菌和病毒檢測時腦脊液量不少于1ml；用于真菌和抗酸桿菌檢測腦脊液量不少于2ml。 6、穿刺液培養(yǎng)標(biāo)本 1)穿刺液培養(yǎng)標(biāo)本包括胸水、腹水、心包液、關(guān)節(jié)液、鞘膜液等。2)采集時間：一般在用抗生素等抗菌藥物治療之前，或在停止使用抗菌藥物時候2～3d采集標(biāo)本。 3)采集方法 ①無菌操作穿刺抽取標(biāo)本或外科手術(shù)采集標(biāo)本； ②標(biāo)本采集量應(yīng)＞1ml(結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)時應(yīng)為1～5ml)； ③標(biāo)本采集后注入無菌小瓶或無菌試管中立即送檢； ④可在盛器中先加入滅菌肝素然后在加入穿刺液，以防止穿刺液凝固(0.5ml肝素可抗凝5ml標(biāo)本)。 7、胃液及膽汁培養(yǎng) 標(biāo)本抽取空腹胃液5ml，置無菌試管內(nèi)送檢；膽汁培養(yǎng)標(biāo)本有十二指腸引流法或膽囊穿刺法或手術(shù)中留取膽汁，采集膽汁量為5ml，置無菌管內(nèi)送檢；胃液和膽汁采集后必須立即送檢。 8、膿汁和病灶分泌物培養(yǎng) 標(biāo)本采集前局部消毒后無菌采取膿汁或病灶分泌物或組織。標(biāo)本采集后立即置無菌管內(nèi)送檢。 9、眼、耳、鼻、咽拭子培養(yǎng)標(biāo)本 1) 采集眼分泌物：先用無菌生理鹽水沖洗眼部，然后用棉拭于拭干，再用無菌棉拭子采集分泌物。 2)采集咽分泌物：先用清水漱口，用壓舌板將舌下向外壓，將咽拭子在咽后壁或懸雍垂后側(cè)涂抹數(shù)次，切勿接觸口腔和舌粘膜。3)采集耳、鼻或鼻咽分泌物：直接用拭子涂抹病灶部位，切勿接觸周圍或皮膚。標(biāo)本采集過程中應(yīng)注意避免粘膜上的正常菌群污染，標(biāo)本采集后連同拭子一起置無菌管內(nèi)送檢。 10、泌尿生殖道培養(yǎng)標(biāo)本 1)尿道分泌物：清洗尿道、采取尿道、溢出的膿性等分泌物，或用無菌拭子插入尿道2～4cm處輕輕轉(zhuǎn)動后取出，置無菌試管中送檢。 2)陰道、宮頸分泌物、通過陰道擴張器，用滅菌拭子采取陰道口或?qū)m頸管1～2cm處分泌物，置無菌試管中送檢。避免陰道分泌物污染拭子。 3)宮腔分泌物：在必要時用外套保護膜的滅菌導(dǎo)管抽取。 4)前列腺液：清洗尿道、沖洗膀胱后用前列腺按摩法采取前列腺液于無菌容器內(nèi)送檢。 5)精液：送檢者應(yīng)5天未排精，清洗尿道后手淫或體外排精法，射精于無菌容器內(nèi)送檢。 6)潰瘍分泌物：滅菌生理鹽水溶液清洗患處，用無菌拭子取其邊緣或基底部的分泌物，置無菌試管中送檢。 11、燒傷感染培養(yǎng)標(biāo)本 燒傷12h后無菌棉拭子操作采集標(biāo)本；要注意從多個創(chuàng)面取樣，燒傷嚴(yán)重感染時易發(fā)生敗血癥，創(chuàng)面取樣同時應(yīng)采集血樣送做血培養(yǎng)(必須同時做需氧菌培養(yǎng)和厭氧菌培養(yǎng))。 12、厭氧菌感染培養(yǎng)標(biāo)本 1)標(biāo)本采集①標(biāo)本不能被正常菌群污染，采集時盡量避免接觸空氣，立即送檢，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作；②血液及其他體液(胸水、腹水、心包液、關(guān)節(jié)液、膽汁、腦脊液等)注入?yún)捬跹囵B(yǎng)，立即送檢；③深部膿腫，在病灶部位開放前取材，可用針管抽取，針頭用無菌膠囊密封，也可用血氣采集針抽取，立即送檢；④抽取液體標(biāo)本后，要盡快排除注射器內(nèi)的空氣。2)標(biāo)本運送①標(biāo)本采集后不得冰箱儲存，必須盡快(半小時內(nèi))送實驗室；②運送方法：A注射器運送(標(biāo)本抽取后盡快排除空氣)或接種到專門的運送培養(yǎng)基中直接運送； B含運送培養(yǎng)基的無氧小瓶運送；C厭氧罐運送(組織塊)；D大量液體標(biāo)本運送時要裝滿標(biāo)本瓶并立即驅(qū)氧，加蓋運送；E一般不采用棉拭子法3)建議使用微生物組合：①細(xì)菌學(xué)涂片：快速回報標(biāo)本中可能的病原微生物②普通細(xì)菌培養(yǎng)：(3天) ③厭氧培養(yǎng)：(7天)④真菌培養(yǎng)：(5天)⑤微生物分子生學(xué)檢測：(2天)13、真菌感染培養(yǎng)標(biāo)本1)淺部真菌感染標(biāo)本采集①皮膚：常規(guī)消毒皮膚，從皮膚癬菌皮損邊緣刮取鱗屑，置無菌平皿內(nèi)送檢，皮膚潰瘍則采集病損邊緣膿汁或組織；②指(趾)指甲：消毒指(趾)指甲并去掉其表面部分，取可疑病變部分，用刀片修成小薄片5～6片置無菌容器內(nèi)送檢；③毛發(fā)：采集根部斷折處，至少5～6根送檢。2)深部真菌感染標(biāo)本采集①血液：無菌采血8～10ml，注入血培養(yǎng)瓶中，立即送檢，如不能立刻送檢時學(xué)培養(yǎng)瓶應(yīng)放室溫，但不可超過8～9h；②腦脊液采樣量不少于3～5ml，分別注入兩支無菌試管中送檢(一管做真菌培養(yǎng)和墨汁染色一管測隱球菌抗原和其他培養(yǎng))；③呼吸道及泌尿生殖道深部真菌感染標(biāo)本采集同一般菌培養(yǎng)標(biāo)本。14、皮膚(主要指傷口、創(chuàng)面膿液等)標(biāo)本采集方法1)對采集標(biāo)本部位應(yīng)首先清除污垢，再以碘酒或酒精消毒，防止皮膚表面污染菌混入影響檢驗結(jié)果，盛放標(biāo)本器皿應(yīng)無菌。2)封閉性膿腫：病灶局部消毒后，以無菌干燥注射器穿刺抽取，將采集的膿液注入滅菌試管，對疑似厭氧菌的膿液，抽取膿液后立即排出注射器內(nèi)的空氣，同時將針頭插入滅菌橡皮塞，防止空氣進入。3)開放性膿腫及膿性分泌物：先做局部消毒再用無菌棉拭子采取膿液及病灶深部分泌物，并置無菌容器內(nèi)送檢。4)大面積燒傷的創(chuàng)面分泌物因創(chuàng)面的部位不同，細(xì)菌種類不同，故應(yīng)用無菌棉拭子多部位采集膿液及分泌物，置于無菌試管。注意事項：燒傷12小時內(nèi)的創(chuàng)面及分泌物中細(xì)菌檢出率較低。15、空氣培養(yǎng)標(biāo)本采集方法1)采樣時間：選擇消毒處理后與進行醫(yī)療活動之前進行采樣。2)采樣高度：與地面垂直高度80～150cm。3)布點方法：室內(nèi)面積≤30㎡，設(shè)一條線上取三點，即中心一點，兩端各距墻1m處取一點；室內(nèi)面積＞30㎡，設(shè)東、南、西、北、中5點，其中東、南、西、北距墻1m。4)采樣方法：用9cm直徑普通培養(yǎng)瓊脂平板在采樣點暴露5分鐘后時間培養(yǎng)。5)標(biāo)本保存：采樣后必須盡快送檢。②在平皿上注明各采自哪個室及布點的位置(如東或南)，用膠布把平皿和平皿蓋子固定好以免在時間途中平皿和平皿蓋子分離而造成污染。③將封好的平皿裝入自封袋，并將自封袋封好后送檢。1.血液、骨髓、無菌體液：（1）嚴(yán)格消毒、避免體表正常菌群的污染。（2）應(yīng)在抗生素使用之前抽血。如果病人已使用抗生素，應(yīng)在下次用藥前采血。（3）由于血液、骨髓、無菌體液含有極少量的病原體，就可以造成感染性疾病，而實驗室檢出率與病原體數(shù)量有關(guān)，并非只要有病原體就能檢驗出來，因此血液、骨髓、無菌體液等必須增菌才能獲得滿意結(jié)果。成人未使用抗生素治療采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水、關(guān)節(jié)液3-10毫升接種培養(yǎng)瓶；厭氧培養(yǎng)接種上述標(biāo)本3-10毫升于厭氧培養(yǎng)瓶。（4）由于菌血癥、敗血癥是間歇排菌，應(yīng)在發(fā)熱高峰時采血，對于感染性心內(nèi)膜炎患者應(yīng)增加采血次數(shù)，以提高陽性率。2.尿液：（1）導(dǎo)尿法：是一種無菌采集法，主要適用于手術(shù)后患者，取10-15毫升尿液于無菌容器內(nèi)送檢，但留置導(dǎo)尿管易造成醫(yī)院內(nèi)感染。（2）中段尿采集法：是臨床上最多采用的方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗外陰及陰道口；男性病人應(yīng)翻轉(zhuǎn)包皮沖洗，用1：1000新潔爾滅消毒尿道口，用無菌紗布擦干，讓病人排尿，棄去前段尿，收集中段尿10—20ml，盛于無菌容器內(nèi)，立即加蓋送檢。（3）腎盂尿采集法：為確定菌尿是否來自腎臟，可用導(dǎo)尿管采集腎盂尿。首先充分沖洗膀胱，以最后一次沖洗尿作對照，后用導(dǎo)尿管插入輸尿管，分別標(biāo)記左右側(cè)，收集3次尿；如果輸尿管菌數(shù)比對照尿菌數(shù)多或第3次尿中菌數(shù)比第1次多，該菌尿可能來自腎臟。反之，如果第1次尿菌數(shù)多于第3次尿菌數(shù)，則可能來自膀胱。腎盂尿采集法一般應(yīng)該請泌尿科醫(yī)師協(xié)助進行，并確實做好標(biāo)記，以防左右側(cè)搞錯。（4）膀胱穿刺尿采集法：將病人恥骨上皮膚消毒后，以無菌針筒作膀胱穿刺。此法主要用于尿液中厭氧菌的培養(yǎng)，故在取得尿液后，針頭插于橡皮塞上送檢。當(dāng)兒童或嬰兒采集中段尿困難或培養(yǎng)結(jié)果與患者病情有矛盾時，可考慮用此法采集尿液。（5）留尿法：尿液檢查結(jié)核分枝桿菌時，可用一潔凈容器，留取24h的尿液，取其沉淀部分200-250毫升盛于清潔瓶內(nèi)送檢。2、糞便標(biāo)本采集和處理1）采集時間：腹瀉患者于急性期，盡量在用藥前采集糞便；傷寒患者于發(fā)病2w以后采集糞便；懷疑霍亂3.痰液：正常人下呼吸道是無菌的，上呼吸道有正常菌群寄居。下呼吸道的分泌物必須通過上呼吸道，常受上呼吸道的正常菌群的污染。因此對于下呼吸道分泌物培養(yǎng)出來的結(jié)果必須分析、判斷。一般要求病人清晨用無菌生理鹽水漱口6次，再用冷開水漱口一次，用力咳深部的痰液于無菌容器內(nèi)送檢，避免口水的污染。對于痰液不能自主咳出，可采用高滲鹽水霧化吸入排痰。4.皮膚、創(chuàng)面：首先按常規(guī)消毒皮膚，然后用無菌注射器抽吸皮下病變部分，或用無菌棉簽取痂下膿性分泌物送檢。5.生殖道分泌物：根據(jù)病人主述臨床癥狀，采用不同方式取材：若病人白帶呈淡黃色，稀水樣，考慮滴蟲感染，用無菌棉簽取陰道分泌物于1毫升生理鹽水內(nèi)送檢，注意保溫，因為目前滴蟲的檢驗主要看鞭毛擺動的動力。若病人白帶呈“豆腐渣”樣，瘙癢癥狀，用無菌棉簽取“豆腐渣”樣白帶送檢，選擇不同的送檢方式和檢驗方法可獲得不同的檢驗結(jié)果，若懷疑淋病患者，對于男性急性患者，用一支棉簽檫去尿道口膿液，輕輕擠壓尿道口，再用一支棉簽取其膿液送檢；對于男性慢性患者或治療后復(fù)查的患者，用一支棉簽伸入尿道口2-4厘米，停留數(shù)秒鐘，旋轉(zhuǎn)取出，因為尿道口寄居的是鱗狀上皮細(xì)胞，尿道2-4厘米寄居的是柱狀上皮細(xì)胞，這是淋球菌寄居的地方。對于女性患者，用溫水濕潤的擴陰器，取陰道分泌物或?qū)m頸分泌物，棉簽停留數(shù)秒鐘，讓棉簽充分吸附分泌物。從直腸取材時，應(yīng)將棉簽插入肛門2.5厘米以上，碰到糞便，應(yīng)換一個棉簽重取。檢查淋球菌性咽炎時，應(yīng)從扁桃體及扁桃體窩取材。支原體檢查：支原體是簡單的原核細(xì)胞，沒有細(xì)胞壁，缺乏許多細(xì)胞器，直接鏡檢沒有意義，只有通過培養(yǎng)，取材顯得重要，采集標(biāo)本時，男性患者可用尿道拭子或清晨中段尿培養(yǎng)，女性推薦陰道拭子。衣原體檢查：采取尿道標(biāo)本，至少在排尿1小時后采集，對于男性尿道取材，棉拭子應(yīng)伸入尿道2-4厘米（因為衣原體寄生在粘膜柱狀上皮細(xì)胞，而不是寄生在復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞中），轉(zhuǎn)動拭子以獲得細(xì)胞；對于女性尿道取材，先用一個拭子檫凈尿道口，再用棉拭子（?。┥烊肽虻?厘米，輕輕轉(zhuǎn)動拭子取出，對于女性宮頸取材，用溫水濕潤的擴陰器擴張陰道，先用一個拭子檫凈宮頸口，然后再用棉拭子（?。┥烊雽m頸內(nèi)1-2厘米，用力摩檫采取宮頸細(xì)胞，不采用膿液作培養(yǎng)。直腸取材；可將拭子插入肛門括約肌，在肛門和直腸結(jié)合處沿腸壁轉(zhuǎn)動，持續(xù)10-30秒，以吸取微生物，并避免糞便的污染。注意：尿液、精液、服過抗生素的病人標(biāo)本以及新近用過某些陰道制劑、清潔劑等病人標(biāo)本不宜作衣原體檢查。血液標(biāo)本的采集指南一、血液標(biāo)本的正確采集方法：1、采血時間：（1）采血應(yīng)盡可能在上午6-9時進行，如果不得不在其他時間急查一些項目，評價檢驗結(jié)果應(yīng)注意以下晝夜節(jié)律變化。（見附表）（2）采血前病人應(yīng)禁食12小時，采血前4小時禁止飲茶。（3）采血盡量安排在其他檢查和治療之前進行。很多指標(biāo)受晝夜節(jié)律影響，現(xiàn)將晝夜變化較大的指標(biāo)列表如下：檢驗指標(biāo)峰值期低值期 增加幅度（%）催乳素5-710-12 80-100TSH 20-2 7-13 5-15T4 8-12 23-3 10-20睪酮2-420-2430-50血鉀14-1623-15-10血紅蛋白6-822-248-15血清鐵14-182-450-70腎上腺素9-122-530-50去甲腎上腺素9-12 2-5 50-120嗜酸細(xì)胞4-618-2030-40腎上腺皮質(zhì)激素5-821-3180-200磷酸鹽2-48-1230-402、采血姿勢和止血帶的使用：對于有些檢驗指標(biāo)來說，臥位采血與坐、立位采血結(jié)果是有區(qū)別的。坐、立位與臥位相比，靜脈滲透壓增加，一部分水從心血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到間質(zhì)中去。正常直立位時血漿總量比臥位減少12%左右。血液中體積大于4nm的成分不能通過血管壁轉(zhuǎn)移到間質(zhì)中去，使其血漿含量升高5-15%。常見的指標(biāo)有：Hb、WBC、RBC、RBC比積、鈣、AST、ALP、IGM、IGG、IGA、ALB、TP、CHOL、TG、LDL-CHOL、甲狀腺素等。靜脈壓的改變又進一步導(dǎo)致血管活性物質(zhì)的釋放，直立位時，腎上腺素、血管緊張素和去甲腎上腺素都有7-70%不等的升高。止血帶的使用也會改變靜脈壓力，從而引起與體位改變類似的檢驗指標(biāo)的改變。建議：采血時，應(yīng)盡量統(tǒng)一采血姿勢；比較檢驗結(jié)果時，要考慮姿勢的影響。應(yīng)盡量在使用止血帶在1分鐘內(nèi)采血；采血時，勿讓患者反復(fù)做攥拳運動；看見回血，應(yīng)馬上松開止血帶。當(dāng)需要重復(fù)使用止血帶時，應(yīng)使用另一上臂。禁止在輸液側(cè)采血，這樣采血對檢驗結(jié)果有很大的偏差。3、避免溶血：溶血通常被定義為：血細(xì)胞成分釋放到血漿或血清中。血液由血漿和血細(xì)胞成分組成。很多指標(biāo)在血細(xì)胞中的濃度比在血漿中要高很多如：乳酸脫氫酶、血紅素、轉(zhuǎn)氨酶、和鉀等等。因此樣本的溶血會嚴(yán)重干擾檢驗檢測的結(jié)果。溶血又分為兩種：顯性溶血和非顯性溶血。顯性溶血：指樣本經(jīng)離心，血漿或血清呈現(xiàn)或深或淺的紅顏色，這種紅色是由紅細(xì)胞中的血紅素釋放出來造成的。非顯性溶血：血紅素大于或等于300mg/L時才能被肉眼看見，同時血小板和白細(xì)胞的溶解并沒有血紅素的釋放，這種肉眼不可見的溶血稱非顯性溶血。（LDH、AST、ALT、K、HB、等值異常升高與臨床病人癥狀不符時,應(yīng)首先考慮非顯性溶血原因.）建議:（1）盡量不要在留置病人體內(nèi)的動、靜脈導(dǎo)管內(nèi)采血。有資料表明，從導(dǎo)管采血比直接從靜脈采血發(fā)生溶血的可能性要大4倍左右。（若確需從導(dǎo)管中采血，為防止抗凝劑污染血樣，應(yīng)棄去相當(dāng)于導(dǎo)管體積2倍的前幾毫升血液。）（2）靜脈穿刺采血時，忌為增加血流而擠壓穿刺部位而造成溶血發(fā)生。（3）混勻含抗凝劑的試管時忌用力搖晃，造成溶血，正確的做法是輕輕地顛倒混勻3-4次即可。不含抗凝劑的真空采血管采完血樣后禁止搖晃。所有采好的血樣應(yīng)豎直放置保存。（4）含有抗凝劑的試管采血量比例一定要嚴(yán)格按照規(guī)定采取，采血量不足而相對于試管中的抗凝劑來說，一是相對單位體積內(nèi)的血樣被抗凝劑稀釋造成檢驗結(jié)果的偏低，另一方面由于滲透壓的改變可能發(fā)生溶血。如果采血量超過規(guī)定比例，則達(dá)不到對血樣的抗凝效果，出現(xiàn)血樣凝固或有大量的小凝塊，直接造成樣本的不能檢測或檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。4、建議臨床上采血的順序：（1）血培養(yǎng)（2）不含抗凝劑的試管（干燥管）（3）含枸椽酸鹽抗凝劑的試管（血沉、血交叉、凝血四項）（4）含肝素抗凝劑的試管（5）含EDTA抗凝劑的試管（血常規(guī)）（6）含糖分解抑制劑的試管（主要是測定乳酸和葡萄糖用）

高考語文試卷一、語言文字運用（15分）1．在下面一段話的空缺處依次填入詞語，最恰當(dāng)?shù)囊唤M是（3分）提到桃花源，許多人會聯(lián)想到瓦爾登湖。真實的瓦爾登湖，早已成為▲的觀光勝地，梭羅的小木屋前也經(jīng)常聚集著▲的游客，不復(fù)有隱居之地的氣息。然而虛構(gòu)的桃花源一直就在我們的心中，哪怕▲在人潮洶涌的現(xiàn)代城市，也可以獲得心靈的寧靜。A．名聞遐邇聞風(fēng)而至雜居 B．名噪一時聞風(fēng)而至棲居C．名噪一時紛至沓來雜居 D．名聞遐邇紛至沓來棲居2．在下面一段文字橫線處填入語句，銜接最恰當(dāng)?shù)囊豁検牵?分）在南方，芭蕉栽植容易，幾乎四季常青?！劣谠掠辰队啊⒀簹埲~，那更是詩人畫家所向往的了。①它覆蓋面積大，吸收熱量大，葉子濕度大。②古人在走廊或書房邊種上芭蕉，稱為蕉廊、蕉房，饒有詩意。③因此蕉陰之下，是最舒適的小坐閑談之處。④在旁邊配上幾竿竹，點上一塊石，真像一幅元人的小景。⑤在夏日是清涼世界，在秋天是分綠上窗。⑥小雨乍到，點滴醒人；斜陽初過，青翠照眼。A．①③②④⑥⑤ B．①④②③⑥⑤C．②①④③⑤⑥ D．②③④①⑤⑥3．下列詩句與“憫農(nóng)館”里展示的勞動場景，對應(yīng)全部正確的一項是（3分）①笑歌聲里輕雷動，一夜連枷響到明②種密移疏綠毯平，行間清淺縠紋生③分疇翠浪走云陣，刺水綠針抽稻芽④陰陰阡陌桑麻暗，軋軋房櫳機杼鳴A．①織布②插秧③車水④打稻 B．①織布②車水③插秧④打稻C．①打稻②插秧③車水④織布D．①打稻②車水③插秧④織布4．閱讀下圖，對VR（即“虛擬現(xiàn)實”）技術(shù)的解說不正確的是一項是（3分）A．VR技術(shù)能提供三個維度的體驗：知覺體驗、行為體驗和精神體驗。 B．現(xiàn)有的VR技術(shù)在精神體驗上發(fā)展較快，而在知覺體驗上發(fā)展較慢。C．VR技術(shù)的未來方向是知覺體驗、行為體驗和精神體驗的均衡發(fā)展。D．期許的VR體驗將極大提高行為體驗的自由度和精神體驗的滿意度。二、文言文閱讀（20分）閱讀下面的文言文，完成5—8題。臨川湯先生傳鄒迪光先生名顯祖，字義仍，別號若士。豫章之臨川人。生而穎異不群。體玉立，眉目朗秀。見者嘖嘖曰：“湯氏寧馨兒?！蔽鍤q能屬對。試之即應(yīng)，又試之又應(yīng)，立課數(shù)對無難色。十三歲，就督學(xué)公試，補邑弟子員。每試必雄其曹偶。庚午舉于鄉(xiāng)，年猶弱冠耳。見者益復(fù)嘖嘖曰：“此兒汗血，可致千里，非僅僅蹀躞康莊也者?！倍〕髸?，江陵公①屬其私人啖以巍甲而不應(yīng)。曰：“吾不敢從處女子失身也?！惫m一老孝廉乎，而名益鵲起，海內(nèi)之人益以得望見湯先生為幸。至癸未舉進士，而江陵物故矣。諸所為附薰炙者，骎且澌沒矣。公乃自嘆曰：“假令予以依附起，不以依附敗乎？”而時相蒲州、蘇州兩公，其子皆中進士，皆公同門友也。意欲要之入幕，酬以館選，而公率不應(yīng)，亦如其所以拒江陵時者。以樂留都山川，乞得南太常博士。至則閉門距躍，絕不懷半刺津上。擲書萬卷，作蠹魚其中。每至丙夜，聲瑯瑯不輟。家人笑之：“老博士何以書為？”曰：“吾讀吾書，不問博士與不博士也?！睂ひ圆┦哭D(zhuǎn)南祠部郎。部雖無所事事，而公奉職毖慎，謂兩政府進私人而塞言者路，抗疏論之，謫粵之徐聞尉。居久之，轉(zhuǎn)遂昌令。又以礦稅事多所蹠戾②，計偕之日，便向吏部堂告歸。雖主爵留之，典選留之，御史大夫留之，而公浩然長往，神武之冠竟不可挽矣。居家，中丞惠文，郡國守令以下，干旄往往充斥巷左，而多不延接。即有時事，非公憤不及齒頰。人勸之請托，曰：“吾不能以面皮口舌博錢刀，為所不知后人計?！敝复采蠒局骸坝写瞬回氁??！惫跁鵁o所不讀，而尤攻《文選》一書，到掩卷而誦，不訛只字。于詩若文無所不比擬，而尤精西京六朝青蓮少陵氏。公又以其緒余為傳奇，若《紫簫》、《還魂》諸劇，實駕元人而上。每譜一曲，令小史當(dāng)歌，而自為之和，聲振寥廓。識者謂神仙中人云。公與予約游具區(qū)靈巖虎丘諸山川，而不能辦三月糧，逡巡中輟。然不自言貧，人亦不盡知公貧。公非自信其心者耶？予雖為之執(zhí)鞭，所忻慕焉。（選自《湯顯祖詩文集》附錄，有刪節(jié)）[注]①江陵公：指時相張居正，其為江陵人。②蹠戾：乖舛，謬誤。5．對下列加點詞的解釋，不正確的一項是（3分）A．每試必雄其曹偶 雄：稱雄B．酬以館選 酬：應(yīng)酬C．以樂留都山川 樂：喜愛D．為所不知后人計 計：考慮6．下列對原文有關(guān)內(nèi)容的概括和分析，不正確的一項是（3分）A．湯顯祖持身端潔，拒絕了時相張居正的利誘，海內(nèi)士人都以結(jié)識他為榮幸。B．因為上書批評當(dāng)權(quán)者徇私情、塞言路，湯顯祖被貶官至廣東，做了徐聞尉。C．湯顯祖辭官回家后，當(dāng)?shù)毓賳T爭相與他交往，而湯顯祖不為私事開口求人。D．湯顯祖與鄒迪光相約三月份到江南一帶游玩，但沒準(zhǔn)備好糧食，因而作罷。7．把文中畫線的句子翻譯成現(xiàn)代漢語。（10分）（1）見者益復(fù)嘖嘖曰：“此兒汗血，可致千里，非僅僅蹀躞康莊也者?！保?）然不自言貧，人亦不盡知公貧。公非自信其心者耶？予雖為之執(zhí)鞭，所忻慕焉。8．請簡要概括湯顯祖讀書為文的特點。（4分）三、古詩詞鑒賞（11分）閱讀下面這首唐詩，完成9—10題。學(xué)諸進士作精衛(wèi)銜石填海韓愈鳥有償冤者，終年抱寸誠?？阢暽绞?xì)，心望海波平。渺渺功難見，區(qū)區(qū)命已輕。人皆譏造次，我獨賞專精。豈計休無日，惟應(yīng)盡此生。何慚刺客傳，不著報讎名。9．本讀前六句是怎樣運用對比手法勾勒精衛(wèi)形象的？請簡要分析。(6分)10．詩歌后六句表達(dá)了作者什么樣的人生態(tài)度？（5分）四、名句名篇默寫（8分）11．補寫出下列名句名篇中的空缺部分。（1）名余曰正則兮，__________________。（屈原《離騷》）（2）__________________，善假于物也。（荀子《勸學(xué)》）（3）艱難苦恨繁霜鬢，__________________。（杜甫《登高》）（4）樹林陰翳，__________________，游人去而禽鳥樂也。（歐陽修《醉翁亭記》）（5）__________________，抱明月而長終。（蘇軾《赤壁賦》）（6）浩蕩離愁白日斜，__________________。（龔自珍《己亥雜詩》）（7）道之以德，__________________，有恥且格。（《論語·為政》）（8）蓋文章，經(jīng)國之大業(yè)，__________________。（曹丕《典論·論文》）五、現(xiàn)代文閱讀（一）（15分）閱讀下面的作品，完成12~14題。表妹林斤瀾矮凳橋街背后是溪灘，那灘上鋪滿了大的碎石，開闊到叫人覺著是不毛之地。幸好有一條溪，時寬時窄，自由自在穿過石頭灘，帶來水草野樹，帶來生命的歡喜。灘上走過來兩個女人，一前一后，前邊的挎著個竹籃子，簡直有搖籃般大，里面是衣服，很有點分量，一路拱著腰身，支撐著籃底。后邊的女人空著兩手，幾次伸手前來幫忙，前邊的不讓。前邊的女人看來四十往里，后邊的四十以外。前邊的女人不走現(xiàn)成的小路，從石頭灘上斜插過去，走到一個石頭圈起來的水潭邊，把竹籃里的東西一下子控在水里，全身輕松了，透出來一口長氣，望著后邊的。后邊的走不慣石頭灘，盯著腳下，挑著下腳的地方。前邊的說：“這里比屋里清靜，出來走走，說說話……再呢，我要把這些東西洗出來，也就不客氣了。”說著就蹲下來，抓過一團按在早鋪平好了的石板上，拿起棒槌捶打起來，真是擦把汗的工夫也節(jié)約了?？雌饋砗筮叺氖强腿?，轉(zhuǎn)著身于看這個新鮮的地方，有一句沒一句地應(yīng)著：“水倒是清的，碧清的……樹也陰涼……石頭要是走慣了，也好走……”“不好走，一到下雨天你走走看，只怕?lián)鷶嗔四_筋。哪有你們城里的馬路好走?！薄跋掠晏煲蚕匆路?”“一下天呢，二十天呢。就是三十天不洗也不行。嗐，現(xiàn)在一天是一天的事情，真是日日清，月月結(jié)?！笨腿穗S即稱贊：“你真能干，三表妹，沒想到你有這么大本事，天天洗這么多。”主人微微笑著，手里捶捶打打，嘴里喜喜歡歡的：事情多著呢。只有晚上吃頓熱的，別的兩頓都是馬馬虎虎。本來還要帶子，現(xiàn)在托給人家。不過洗完衣服，還要踏縫紉機?！笨腿似鋵嵤莻€做活的能手，又做飯又帶孩子又洗衣服這樣的日子都過過?，F(xiàn)在做客人看著人家做活，兩只手就不知道放在哪里好。把左手搭在樹杈上，右手背在背后，都要用點力才在那里閑得住。不覺感慨起來：“也難為你，也虧得是你，想想你在家里的時候，比我還自在呢?！敝魅朔畔掳糸常瑑墒忠豢滩煌５厝啻昶饋恚骸白鲎鲆簿土?xí)慣了。不過，真的，做慣了空起兩只手來，反倒沒有地方好放。鄉(xiāng)下地方，又沒有什么好玩的，不比城里。”客人心里有些矛盾，就學(xué)點見過世面的派頭，給人家看，也壓壓自己的煩惱：“說的是，”右手更加用力貼在后腰上，“空著兩只手不也沒地方放嘛。城里好玩是好玩，誰還成天地玩呢。城里住長久了，一下鄉(xiāng)，空氣真就好，這個新鮮空氣，千金難買。”單夸空氣，好比一個姑娘沒有什么好夸的，單夸她的頭發(fā)。主人插嘴問道：“你那里工資好好吧？”提起工資，客人是有優(yōu)越感的，卻偏偏埋怨道：“餓不死吃不飽就是了，連獎金帶零碎也有七八十塊?！薄澳鞘亲龆嘧錾僬諛幽醚?！”“還吃著大鍋飯?！薄安蛔霾蛔鲆材昧呤?？”“鐵飯碗！”客人差不多叫出來，她得意。主人不住手地揉搓，也微微笑著?？腿说勾蚱稹氨Р黄健眮恚骸澳愫闷猓?/p>