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第三章培養(yǎng)基及一般操作技術2023/4/182第一節(jié)培養(yǎng)基的概念、種類和成分第二節(jié)培養(yǎng)基制備

第三節(jié)一般操作技術

在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官。2023/4/183

第一節(jié)培養(yǎng)基的概念、種類和成分

一、概念：培養(yǎng)基（culturemedium）是人工配制的含有各種營養(yǎng)成分，經(jīng)過嚴格滅菌的適于植物生長重要基質(zhì)。2023/4/185不同的植物不同培養(yǎng)部位不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡稱MS培養(yǎng)基)，也有對某些成分進行改良稱作改良培養(yǎng)基。2023/4/186

培養(yǎng)基種類MS培養(yǎng)基1962B5培養(yǎng)基1968White培養(yǎng)基1937N6培養(yǎng)基1975KM-8P培養(yǎng)基1974Miller培養(yǎng)基1965Nitsch培養(yǎng)基1963WPM培養(yǎng)基1933

1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。

特點：無機鹽離子濃度高，硝酸鹽含量較高廣泛用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)2023/4/187MS培養(yǎng)基及特點:

1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。特點：含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。雙子葉植物尤其木本植物組培可選擇2023/4/188B5

培養(yǎng)基及特點：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計的2023/4/1810N6培養(yǎng)基特點：

特點;成分較簡單，KNO3

和(NH4)2SO4含量高適合花藥培養(yǎng)

特點：有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素廣泛用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，包括融合的培養(yǎng)2023/4/1811

KM-8P培養(yǎng)基特點：

1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設計的。2023/4/1813

培養(yǎng)基成分三、培養(yǎng)基的成分水無機鹽有機物植物激素培養(yǎng)體的支持材料其它輔助性物質(zhì)

水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止儲藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。2023/4/1814（一）水

無機營養(yǎng)成分就是人們平常所說的礦物質(zhì)、無機鹽或無機元素。它們在植物生活中具有非常重要的作用。

如氮（N）、硫（S）、磷（P）是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和許多生物催化劑即酶的主要或重要組分。它們與蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和酶的結構、功能、活性等有直接的不可缺少的關系。

2023/4/1815（二）無機元素大量元素（以Ms培養(yǎng)基為例）序號化學式化學名稱用量mg/L1KNO3硝酸鉀19002NH4NO3硝酸銨16503KH2PO4磷酸二氫鉀1704MgSO4.7H2O硫酸鎂3705CaCL2.4H2O二氯化鈣440微量元素（以MS培養(yǎng)基為例）序號化學名稱化學式用量（mg/L)1碘化鉀KI0.832硼酸H3BO36.23硫酸錳MnSO4.4H2O22.34硫酸鋅ZnSO4.7H2O8.65鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O0.256硫酸銅CuSO4.5H2O0.0257氯化鉀CoCL2.6H2O0.0251.大量元素

(1)N:是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。

在制備培養(yǎng)基時以硝態(tài)氮（NO3-N)或氨態(tài)氮（NH4-N)兩種形式供應。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有硝態(tài)氮（NO3-)又含有氨態(tài)氮（NH4+)。氨態(tài)氮（NH4-N)對植物生長較為有利。供應的物質(zhì)有KNO3、NH4NO3等。有時，也添加氨基酸來補充氮素。

缺氮時某些植物的愈傷組織會出現(xiàn)一種很引人注目的花色素苷的顏色，愈傷組織內(nèi)部不能形成導管。2023/4/1819

(3)K對碳水化合物合成、轉移、以及氮素代謝等有密切關系。

K增加時，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達，對胚的分化有促進作用。但濃度不易過大，一般為1-3mg／L為好。

制備培養(yǎng)基時，常以KCl、KNO3等鹽類形式提供。2023/4/1821(4)Mg、S和CaMg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。

常以MgS04·7H20提供，用量為1-3mg／L較為適宜；

Ca是構成細胞壁的一種成分，Ca對細胞分裂、保護質(zhì)膜不受破壞有顯著作用

常以CaCl2·2H20提供，缺硫時培養(yǎng)的植物組織會明顯的退綠。2023/4/18222.微量元素

微量元素包括Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo、Co等。鐵是一些酶（氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等）的重要組成成分，又是葉綠素形成的必要條件

培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促進作用

但由于Fe的特殊性質(zhì)，即很不穩(wěn)定、易沉淀，需要在酸性條件下才能比較穩(wěn)定，故在培養(yǎng)基配制時常常把Fe鹽單獨配制，且以螯合物的形式存在2023/4/1823Zn是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等的活化劑。Cu是細胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影響氧化還原過程。Mo是硝酸還原酶和鉬鐵蛋白的金屬成分。2023/4/1825有機營養(yǎng)成分2023/4/1826碳水化合物維生素氨基酸肌醇天然復合物椰乳、水解酪蛋白、水解乳蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、西紅柿汁、香蕉粉、橘子汁、可可汁（三）有機元素2023/4/1829種類：VB1(鹽酸硫胺素):促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力VB6(鹽酸吡哆醇):促根生長

Vpp(煙酸):與代謝和胚發(fā)育有關

Vc(抗壞血酸):防組織褐變有時還使用生物素、葉酸、核黃素等。濃度：0.1－1.0mg/L

2.維生素(vitamin)

3.

肌醇（環(huán)己六醇）2023/4/1830促進糖類物質(zhì)的相互轉化和活性物質(zhì)作用的發(fā)揮促進愈傷組織生長以及胚狀體和芽的形成對組織細胞繁殖、分化的促進作用使用濃度100mg/L注：用量過多則促褐變

是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。

培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。2023/4/18314.氨基酸

為了特殊的培養(yǎng)目的，在一部分培養(yǎng)基中還添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西紅柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁等天然復合物以及活性炭，滲透調(diào)節(jié)劑等。2023/4/18325.天然復合物

是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復合物。在愈傷組織和細胞培養(yǎng)中有促進作用。一般使用濃度在10％-20％2023/4/18331)椰乳

用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應用，對發(fā)育有促進作用。濃度：150-200ml/l2023/4/18342)香蕉

去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用，

用量為150-200g／L對pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。2023/4/18353)馬鈴薯

為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸（含有約20種氨基酸的混合物），使用濃度為100-200mg／L受酸和酶的作用易分解。2023/4/18364)水解酪蛋白或水解乳蛋白

酵母提取液(YE)(0.01％-0.05％)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0．01％-0．5％)蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實、未熟玉米的胚乳等。2023/4/18375)其他

2023/4/1838(四)植物激素

植物激素是指自然狀態(tài)下植物體內(nèi)合成，并從產(chǎn)生處運送到別處，對生長發(fā)育產(chǎn)生顯著作用的微量（1微摩爾/升以下）有機物。

植物生長調(diào)節(jié)劑是指一些具有植物激素活性的人工合成的物質(zhì)。植物激素（植物生長調(diào)節(jié)劑）1、生長素類：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。2、細胞分裂素類：KT，6-BA，ZT等。3、赤霉素類；GA1-GA4，GA7，GA9，GA16，GA24，GA25等4、脫落酸：ABA5、乙烯2023/4/1840植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)植物激素植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中使用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有生長素類和細胞分裂素類兩大類，少數(shù)培養(yǎng)基中還添加赤霉素GA3等2023/4/1841

1）種類IAA

NAA

IBA

2,4－D

2）作用誘導愈傷組織形成和根分化，促進細胞分裂和伸長生長。根對生長素最敏感，在極低濃度下(10.5-10.8mg／L)就可促進生長，其次是莖和芽。3）濃度0.05－5mg/L

天然的生長素熱穩(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)1、生長素類IAA(吲哚乙酸)

是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)

在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。2023/4/1842

IBA(吲哚丁酸)

是促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)

起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應。生長素配制可先用少量95％酒精助溶。2,4-D可用0.1mol／L的NaOH或KOH助溶。生長素常配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。2023/4/1843(2)GA(赤霉素)

種類：有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應等各有不同。培養(yǎng)基中添加的是GA3。作用：促莖伸長，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；

特性：赤霉素溶于酒精，配制時可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％-100％失效，應當采用過濾滅菌法加入。2023/4/1844(3)細胞分裂素類

這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA、Kt(kinetin)、玉米素Ze等。其中Ze活性最強，但非常昂貴，常用的是6-BA。

細胞分裂素使用濃度：0.05-10mg／L。2023/4/1845在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素有三個作用：①誘導芽的分化促進側芽萌發(fā)生長。細胞分裂素與生長素相互作用，當組織內(nèi)細胞分裂素／生長素的比值高時，誘導愈傷組織或器官分化出不定芽。②促進細胞分裂與擴大。細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，③抑制根的分化。避免在生根培養(yǎng)時使用。2023/4/18461、瓊脂(agar)

作用：最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。特性：溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。濃度：瓊脂的用量在6-10g／L之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。2023/4/1847(五)、培養(yǎng)材料的支持物(六)、其它輔助性物質(zhì)2023/4/18481.抗生物質(zhì)2.抗氧化物3.活性炭種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等用量：5-20mg／L作用：防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失。對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5％-10％的抗菌素。注意：抗生素各有其抑菌譜，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但是應當注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用，使用要慎重。2023/4/18491．抗生物質(zhì)

酚污染：

植物組織在切割時會溢泌一些酚類物質(zhì)，接觸空氣中的氧氣后，自動氧化或由酶類催化氧化為相應的醌類，產(chǎn)生可見的茶色、褐色以致黑色。這些物質(zhì)滲出細胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。

在木本，尤其是熱帶木本及少數(shù)草本植物中較為嚴重。2023/4/18502、抗氧化物

目前還沒有徹底完善的辦法，只能按不同的實際情況，加用一些藥物，并適當降低培養(yǎng)溫度、及時轉移到新鮮培養(yǎng)基上等辦法，使之有不同程度的緩解，當然像嚴格選擇外植體部位、加大接種數(shù)量等也應一并考慮。

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抗酚類氧化常用的藥劑有半胱氨酸及Vc用量：50-200mg／L的濃度方法：洗滌剛切割的外植體表面或過濾滅菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。

其他抗氧化劑：二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。2023/4/1852

活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結構，有很強的吸附作用，可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛及激素等。2023/4/18533、活性炭

使用濃度——通常為0.5-1mg／L

作用——吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物（初代培養(yǎng)）促進新梢的形成和伸長（新梢增殖階段），但其作用有一個閥值，一般為0.1％-0.2％。促進生根（通過減弱光照保護了IAA），由于根的生長加快，吸收能力增強，反過來又促進了莖、葉的生長?；钚蕴靠山档筒Ａ绲漠a(chǎn)生頻率，使用濃度一般0.3％。2023/4/1854

每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此，在使用時要有其量的意識,使活性炭發(fā)揮其積極作用。2023/4/1855

活性炭具有副作用，研究表示按性質(zhì)分基本培養(yǎng)基：MS、MT（MurashigeandTucher）White完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基＋其它成分（激素、有機物質(zhì)等）

第二節(jié)培養(yǎng)基的制備

一、合適培養(yǎng)基的選擇合適培養(yǎng)基的選擇：基本培養(yǎng)基；各種激素的濃度與配比MS培養(yǎng)基適合于大多數(shù)雙子葉植物；B5和N6培養(yǎng)基適合于許多單子葉植物；White培養(yǎng)基適合于根的培養(yǎng)。

首先試用這些培養(yǎng)基進行初步實驗，在基本培養(yǎng)基確定之后，進行不同種類激素濃度和激素間相互比例的配合試驗。2023/4/1857

在植物組織培養(yǎng)工作中，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準確性及配制時的快速移取，而且還便于低溫保藏。2023/4/1858二、母液的配制2023/4/1859

稱量

母液分裝確定培養(yǎng)基

溶解

定容

貼標簽保存于冰箱(一)母液配制流程圖2023/4/1860

一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。(二)母液配制要求(以MS為例)

：具體要求：(1)大量元素母液可配成濃度20倍母液。(2)微量元素母液可配成濃度1000倍的母液。(3)鐵鹽母液可配成100倍的母液，(4)有機物母液可配成100倍的母液。(5)激素母液的配制每種激素必須單獨配成母液，濃度一般配成1mg／ml。用時根據(jù)需要取用。因為激素用量較少，一次可配成50ml或100ml。2023/4/1861IAA、IBA、GA溶于少量的95％的酒精加水定容；NAA熱水或少量95％的酒精加水定容；2,4-D可用少量1molNaOH溶解加水定容；Kt和BA少量1mol的HCI中加水定容；玉米素于少量95％的酒精加熱水到一定濃度。配制好的母液瓶上應分別貼上標簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配1L培養(yǎng)基時應取的量。

2023/4/1862激素溶解方法：Ms母液（儲備液）的配制與保存

成分

用量(g/l)每升培養(yǎng)基取用量(ml)母液1（大量元素20×）NH4NO3KNO3

MgSO4.7H2OCaCL2.2H2OKH2PO4母液2（微量元素1000×）KIH3BO3MnSO4.4H20ZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCL2.6H2O33387.48.83.40.826.222.38.60.250.0250.025

50

１

成分用量（ｇ／ｌ）每升培養(yǎng)基用量（ｍｌ）母液3（鐵鹽100×）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O2.783.73

10母液4（維生素、氨基酸100×）肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸50.0250.0250.0050.1

10三、培養(yǎng)基的制備2023/4/1865移母液調(diào)PH值培養(yǎng)基熬制滅菌稱取蔗糖、瓊脂扎口定容分裝二次定容接種確定配方