第十章吸光光度法10-1吸光光度法10-2吸光光度法儀器

教學(xué)內(nèi)容：物質(zhì)對光的選擇性吸收、光吸收定律及其應(yīng)用條件、摩爾吸光系數(shù)與靈敏度；顯色反應(yīng)及其影響因素；吸光光度法的特點與應(yīng)用、吸光光度法儀器教學(xué)重點：吸收光譜、工作波長的確定、線性范圍、檢出限、準(zhǔn)確度與精密度、回收率教學(xué)難點：參比溶液的選擇、共存離子干擾、絡(luò)合物組成的確定化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er:0.1%～0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃儀器

化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析：微量組分(<1%),Er:1%～5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器例:含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,稱不準(zhǔn)容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測不準(zhǔn)光度法結(jié)果0.048%～0.052%,滿足要求準(zhǔn)確度高靈敏度高I0It光強(qiáng)的測量—分光光度計分光光度法的應(yīng)用：定量測定與定性分析物質(zhì)對光有選擇性吸收

光強(qiáng)的減弱與物質(zhì)濃度的關(guān)系？—朗伯-比爾定律測量光強(qiáng)度的減弱▲光的性質(zhì)及物質(zhì)對光的選擇性吸收●光的性質(zhì)光具有二象性,即波動性和粒子性,可用普朗克方程表示:

c－真空中光速2.99792458×108m/s ~3.0×108m/s－波長，單位：m,cm,mm,m,nm,?1m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10m－頻率，單位：赫芝(周)Hz次/秒

n－折射率，真空中為1光的傳播速度:波動性X磁場向量傳播方向YZx電場向量

h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·s

－頻率

E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光量子，具有能量。(單色光)

橙

白光

青蘭

互補光(即復(fù)合光:由2or多種單色光混合而成的混合光)

黃

綠

青紅紫蘭(單色光)

只有一種波長的光例:I0KMnO4紫光(紫紅色)顏色(i)∝物質(zhì)通過透過青色互補選擇性吸收綠光*全吸收呈黑色*不吸收呈無色單色光：具有相同能量(相同波長)的光.混合光：具有不同能量(不同波長)的光復(fù)合在一起.例如白光/nm顏色互補光400～450紫黃綠450～480藍(lán)黃480～490綠藍(lán)橙490～500藍(lán)綠紅500～560綠紅紫560～580黃綠紫580～610黃藍(lán)610～650橙綠藍(lán)650～760紅

分子對光的吸收與吸收光譜不同顏色的可見光波長及其互補光藍(lán)綠▲光吸收定律（Lambert——Beer定律）●表達(dá)式logI0/I=A=k1b（λ、C、T=const時）Lambert定律=k2C（λ、b、T=const時）Beer定律k·b·c（Lamber-Beer定律）常數(shù)？即：當(dāng)一束平行單色光通過均勻溶液時，Sol的A與Sol的濃度、液層的厚度成正比。

吸光度與光程的關(guān)系

A=abc

0.10b0.202b0.00光源檢測器顯示器參比吸光度與濃度的關(guān)系

A=abc0.10c0.202c0.00光源檢測器顯示器參比cbkA=kbcg/Lcma(L·g·cm)=abcmol/Lcmk(L·mol·cm)=kbc(ε)(ε)-1-1-1-1靈敏度∝正

●靈敏度表示法：

靈敏度<103低例如:K>104高>106

超高∝負(fù)L.D.(檢出限)s=M（g/mol）/k（μg/cm）k,s（桑德爾靈敏度）即指當(dāng)儀器所能測出的Amin=0.001時,單位面積光程內(nèi)能檢出的吸光物質(zhì)的最低含量●a(吸光系數(shù))k（摩爾吸光系數(shù)）k值因c、b的單位而異，如●A∝T（透光度）∵I/I0=T∵T<1T%=T×100∴A=㏒I0/I=－㏒I/I0=－㏒T=㏒1/T=㏒1/T×100%=2－㏒T%=kbcA∝CA∝C正負(fù)定量分析相關(guān)性還可用曲線表示：A=a+kcLD=3Sb/k(斜率)試劑空白11次平行測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差S=√∑[（Xi-x）]/（n-1）2斜率=tgα

截距●定律應(yīng)用的前提條件②入射光不平行，散射前提條件：⑵sol均勻、透明、非散射性⑴入一定的單色光⑶C=10～10（mol/L）線性否則偏離物理因素化學(xué)因素①單色光不純（最主要因素）導(dǎo)致-3﹥10負(fù)偏離﹤10正偏離-4-3-41.入一定的單色光即應(yīng)選用max處或肩峰處測定.

2.sol均勻、透明、非散射性即吸光質(zhì)點形式不變

離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系,應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等).3.C=10～10（mol/L）

濃度增大，分子之間作用增強(qiáng).-3-4①平衡效應(yīng)如：Cr2O7

+H2OHCrO4

2CrO4

+2H橙色黃色2－350nm375nm△入=25nm偏離②酸效應(yīng)如HBH+B∵A總=AHB+AB－=KHBCHB+KB－CB－－∴KB=KHB（偏離可忽略）﹥KHB

C↑正偏離C↓負(fù)偏離③溶劑效應(yīng)極性I2顏色入max+C2H5OH（+）紅棕小+CCl4（－）紫大如I2

++2－－化學(xué)因素必須指出，偏離是由儀器或分析實踐所造成的，并非光吸收定律的缺陷。Vis光度分析是利用有色溶液進(jìn)行，這就需要理想的星色反應(yīng)體系及合適的分析條件。▲影響顯色反應(yīng)的因素

設(shè)：M+R→MR（顯色反應(yīng)）[O]-[H]反應(yīng)絡(luò)合反應(yīng)待測組分顯色劑有色物質(zhì)關(guān)鍵：√●顯色劑或顯色反應(yīng)的選擇標(biāo)準(zhǔn)2．pH:如M+R=MR1,MR2…OHˉH+M(OH)HR……∴△[M]△[R]△KMR,△AMR

導(dǎo)致∴pH=5適宜pH3．t(min):∵M(jìn)R形成 T(℃)顏色穩(wěn)定 Amax∝t,Tt1t2T1T2●測量條件：（1）入：干擾無選用λmax有按A最大，干擾最小的原則入（2）A=0.15～0.80如控制Ws.試液的稀釋或濃縮。（3）校準(zhǔn)b,入，A，T標(biāo)尺刻度等（4）選擇參比溶液：試液顯色劑（R）其它試劑參比溶液———蒸餾水或純?nèi)軇?+試劑空白(即不加試液外其它溶液)+——不加R的試液有吸收無吸收例：在入測量處……選擇催化、抑制反應(yīng)體系，均可選用水作為參比溶液?！夤舛确ǖ膽?yīng)用●單組分的測定(1)工作曲線法：①配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：令C1，C2，C3……Er%:±5%②以入max測其AA1，A2，A3……減?、跘∝C曲線工作曲線④測Ax,由曲線平坦部分求Cx

±0.5%可用差示光度法…*工作曲線不經(jīng)過原點的原因①空白溶液選擇和配制不當(dāng)即用空白液不能使干擾物質(zhì)的光吸收恰好抵消②顯色反應(yīng)和顯色條件選擇不當(dāng)③b與光學(xué)性能不一致④儀器波長刻度不準(zhǔn)⑤T的影響等等。*工作曲線不直的原因①單色光不純，導(dǎo)致A產(chǎn)生負(fù)誤差②有色吸光質(zhì)點，組成不恒定，因而引起顏色強(qiáng)度的變化，工作曲線彎曲③溶液有膠體形成，對光產(chǎn)生散射④溶液存在各種平衡效應(yīng)（如締合、離解、酸堿等）使A不正比于C(2)差示光度法（濃溶液差示光度法）方法原理：參比溶液標(biāo)液普通光度法：C0C2

差示光度法C1＜C2代↑替C2C1C1C2調(diào)T%=100%∵T%:T→7010→100∵A1=K·b·C1∴Ex:±5→±0.5±5→±0.5A2=K·b·C2 即Ex%↓∴準(zhǔn)確度↑∴A2-A1=Kb(C2-C1)

∵b相同(同一種物質(zhì)，同一比色皿)△A＝K·△C(方法原理)應(yīng)用：（1）工作曲線法：△A△C（2）公式法：CX=K·AX+C1,K=(C1-C2)/A2例：丁二酮肟 Ni2+,且A2=0.47,AX=0.52,求Ni%C1=6.12%C2=11.49%∵Ni%=[（C1-C2）/A2]×AX+C1∴Ni%=[(11.49-6.12)/0.47]×0.52+6.12=12.06%●多組分的測定分析：入1→M1,AM入1→(M+N),AM+N

入1→N1,AN入1→(M+N),AN

(1).聯(lián)立方程法：入1,入2→M+N(待測)入1,入2→M+N(標(biāo)液)同上A入1=AM

·入1+AN

·入1A入2=AM

·入2+AN

·入2

(2).作圖法：由A∝C曲線斜率求CM，CN

●絡(luò)合物組成的測定：(1)摩爾比法（適用于α小，n高的絡(luò)合物）α:離解度n；絡(luò)合比(2)等摩爾連續(xù)變化法（適用于a低，穩(wěn)定性高的絡(luò)合物）A1,A2…CR/CMA1,A2…const即A為pH相對應(yīng)的溶液的吸光度pKa=pH+lg(A－AB-)/(AHB－A)▲

測定中的干擾以及消除方法Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍(lán))⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－測Co2＋:(掩蔽法)1.化學(xué)法

Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnRNiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

鈷試劑RH+測Co2＋:(生成絡(luò)合物性質(zhì)不同)消除干擾，也可采取分離法。Fe3+,Cu2+FeSSal（紫紅）Cu2+pH=2.5SSal測Fe3＋:(控制pH)2.物理法—選擇適當(dāng)?shù)臏y定波長515655415500釷-偶氮砷III

鈷-亞硝基紅鹽

AA絡(luò)合物絡(luò)合物試劑試劑/nm/nm1.僅絡(luò)合物有吸收，溶劑作參比。

如phen—Fe2+標(biāo)準(zhǔn)曲線2.待測液也有吸收，被測液作參比。

如測汽水中的Fe3.顯色劑或其他試劑也有吸收，空白溶液作參比

例:鄰二氮菲光度法測Li2CO3中的Fe，參比溶液為不含Li2CO3樣品的所有試劑。4.干擾組分與顯色劑有反應(yīng),又無法掩蔽消除時：1）掩蔽被測組分，再加入顯色劑，作參比.2）加入等量干擾組分到空白溶液中,作參比.

3.選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤?0–2光度分析的方法和儀器方便、靈敏，準(zhǔn)確度差.常用于限界分析.10.2.1光度分析的幾種方法1.目視比色法觀察方向空白c1c2c3c42.光電比色法光電比色計結(jié)構(gòu)示意圖通過濾光片得一窄范圍的光(幾十nm)濾光片吸收濾光片：只允許指定的窄范圍波長光通過，其他波長的光均被吸收.選擇濾光片的原則：濾光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,即濾光片的顏色與有色溶液的顏色互補.3.吸光光度法和分光光度計光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)分光光度計的基本組成通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高.分光光度計的主要部件光源：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠 的光強(qiáng)度,穩(wěn)定。

可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm) 紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)

氙燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈（氣體放電光源）氫燈強(qiáng)度氙燈氫燈鎢燈單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置。

棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同.玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。

利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。波長范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便.－平面透射光柵－反射光柵（廣泛使用）光柵衍射示意圖M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵吸收池(比色皿)：用于盛待測及參比溶液。 可見光區(qū)：光學(xué)玻璃池 紫外區(qū)：石英池檢流計（指示器）： 低檔儀器：刻度顯示中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動掃描記錄檢測器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號。 光電池，光電管，光電倍增管硒光電池（Barrier-layerphotocell）適用于300-800nm,在500-600nm范圍最靈敏。Se陰極Au，Ag半導(dǎo)體h陽極光電管(Phototube)h（片）紅敏管625-1000nm藍(lán)敏管200-625nm光電倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1個光子可產(chǎn)生106～107個電子160-700nm4.吸光光度法儀器主要差異比較可見光（380～780nm）紫外光（200～380nm)中紅外（2.5～50m)光源鎢燈碘鎢燈320～2500氫燈氘燈180～375硅碳棒（紅外線）吸收池材料玻璃（350～3200）石英（185～4000）NaCl晶體5.1.單光束分光光度計可變波長單光束紫外-可見分光光度計示意圖5.分光光度計的基本類型5.2.雙光束分光光度計參比池檢測器濾光片或單色器放大器樣品池光源hv光子檢測器反光鏡反光鏡透明部分扇形鏡正面圖扇形鏡反光鏡柵鏡雙光束型可以消除光源強(qiáng)度變化的影響.▲Vis.UV～Vis.IR單(雙)光束,雙波長光路圖I1I2△A=A入2－A入1=lgI1/I2=(k入2－k入1)bc(與背景吸收無關(guān))5.3.HP8452A多通道二極管陣列分光光度計鍍鋁反射鏡5.4.纖維光度計示意圖5.5.纖維光度計作業(yè):P3011719241.光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外近紫外可見近紅外中紅外遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5m2.5m

~50m50m

~300m參考資料2.光譜種類原子光譜：吸收、發(fā)射、熒光線狀光譜黑體輻射：白熾燈、液、固灼熱發(fā)光連續(xù)光譜分子光譜：紫外、可見、紅外等吸收光譜帶狀光譜I3.分子吸光與發(fā)光4.發(fā)光機(jī)理(JablonskiDiagram)例1蒽的激發(fā)光譜（吸收光譜）和發(fā)射光譜（熒光光譜）5.鎂-Oxine的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光分析法測定血清中的鎂6.熒光光譜的特點Stokes位移：分子熒光的發(fā)射峰相對于吸收峰位移到較長的波長.熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長的選擇無關(guān).鏡像規(guī)則：熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系.

7.磷光分析法

獲得較強(qiáng)磷光應(yīng)采取的措施：1.低溫，

禁阻躍遷,幾率小;系間竄躍,壽命長.S1T1S0無輻射輻射磷光分析儀器液槽：石英液槽放入盛液氮的石英杜瓦瓶.斬波片：在激發(fā)光單色器與液槽之間以及在發(fā)射光單色器與液槽之間各裝一個斬波片.應(yīng)用：主要用于有機(jī)分析,與熒光法互補.室溫2.固體磷光，吸附在濾紙或纖維素上.3.加表面活性劑,形成膠束締合物,增強(qiáng)剛性.4.重原子效應(yīng)(Ag+,Pb2+,Tl+……鹽類),利于系間跨越.例1Solid-substrateroom-temperaturephosphorescenceimmunoassaybasedonanantibodylabeledwithnanoparticlescontainingdibromofluoresceinluminescentmoleculesandanalyticalapplicationD-SiO2(20nm)Fig.2SS-RTPspectrumandthree-dimensionalspectraofSiO2andD-SiO2nanoparticle1.1’:SiO2;2.2’:D-SiO2;Jia-MingLiua,Qiao-meiLua,YanWanga,Shan-shanXua,Xiao-meiLina,Long-DiLib,Shao-QinLin.JournalofImmunologicalMethods,2005,307,34-40Phosphorescencespectrumofimmunecomplex

TheSS-RTPspectrumoftheimmunecomplex(Ab1-IgG-Ab1-D-SiO2)onthepolyamidemembranewasscannedandcomparedwiththatofreagentblank(D-SiO2-Ab1)(Fig.3).ResultsshowedthatthephosphorescenceintensityofAb1-IgG-Ab1-D-SiO2wasobviouslyhigherthanthatofD-SiO2-Ab1.Meanwhile,theλexmax/λemmaxwere451/622nmand460/623nm,respectively.So460/623nmwaschosenasworkingwavelength.Fig.3RTPspectraofAb1-IgG-Ab1-D-SiO21.1.’Polyamidemembrane2.2’.Ab13.3’.Ab1+2