天然產(chǎn)物分離技術(shù)第1頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六前言重要性

天然藥物的開(kāi)發(fā)（WTO，知識(shí)產(chǎn)權(quán)）提取基礎(chǔ)分離第2頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六提取

1文獻(xiàn)化學(xué)成分種類(lèi)

2系統(tǒng)預(yù)試

3提取溶劑

a水（鞣質(zhì)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)）

HClNaOH成鹽溶出冷水、熱水

b醇（乙醇、甲醇）

95%--alkaloids60-70%--皂苷、黃酮苷

40-50%--強(qiáng)心苷

c丙酮、乙酸乙酯、苯等（苷元）第3頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

4提取方法

a冷浸法（3-4次）

優(yōu)缺點(diǎn)

b滲漉法（10倍量）

受熱易分解物溶劑梯度

c煎煮法（3-4次）水或稀醇第4頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六分離

1分類(lèi)

a粗分（部位分離）

b細(xì)分（部位分組分離）

c單離（單體成分分離）

2方法層析（平面層析、柱層析、逆流層析）

SFE

結(jié)晶第5頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六平面層析

TLC

定性：預(yù)試對(duì)照——標(biāo)準(zhǔn)品種類(lèi)：硅膠G,GF254

顯色：廣泛——碘、H2SO4—EtOH

專(zhuān)屬——alkaloids,flavonoids等第6頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六PTLC（PreparativeTLC）

制備量g級(jí)

1吸附劑（adsorbents）材料：Silicagel尺寸：20*2020*40厚度：0.5-2mm2樣品帶手工自動(dòng)點(diǎn)樣器第7頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六樣品帶寬的解決方法a用極性流動(dòng)相展開(kāi)約2cm，使帶變窄b用帶濃縮帶的板子

3流動(dòng)相選擇

三角性法則4樣品的收集洗脫

顯色：定位轉(zhuǎn)移洗脫第8頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

5

PTLC制備樣品時(shí)引入的雜質(zhì)

粘合劑雜質(zhì)指示劑Other(分解物)(Al2O3作吸附劑)

難點(diǎn)解決辦法：SephedexLH-20

第9頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

6技術(shù)發(fā)展

aHPTLCb巨形板TLC

不銹鋼板(60*60)厚度5mm

上樣量＞10gc帶濃縮帶TLCd展開(kāi)方式

多次展開(kāi)（同方向）雙向展開(kāi)

e移植TLC第10頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

OPLC（OverpressureLayerChromatography）又稱(chēng)OverpressureTLC(OPTLC)

1簡(jiǎn)介

1979年Tyihak綜合TLC,HPTLC優(yōu)點(diǎn)，吸收HPLC的某些特點(diǎn)。

平面細(xì)顆粒蒸汽相恒流速第11頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2裝置

3特點(diǎn)

a與傳統(tǒng)PTLC比較

b效率50mg~0.5g1hc優(yōu)點(diǎn)

4制備型OPLC

聯(lián)機(jī)檢測(cè)分段收集

5應(yīng)用氨基酸，多肽，胡蘿卜素，生物堿等第12頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六離心薄層層析（CTLC）

centrifugalTLC,Chromatotron1概述

CTLC是在TLC和柱色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)利用旋轉(zhuǎn)離心力，連續(xù)洗脫

2儀器傾斜盤(pán)流動(dòng)相中央進(jìn)入梯度、UV檢測(cè)、N2保護(hù)固定相活化反復(fù)使用第13頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

3特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

（1）快速<30min

（2）流動(dòng)相少（3）可反復(fù)使用（4）進(jìn)樣方便（5）直接洗脫（6）直接檢測(cè)，接收靈活（7）可梯度洗脫（8）占地小，移動(dòng)方便（9）分離雜質(zhì)少第14頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

3特點(diǎn)

缺點(diǎn)：

（1）固定相限制（2）Rf值（3）顯色（4）收集污染（5）上樣量少

4應(yīng)用

生物堿、人參皂苷

5注意事項(xiàng)第15頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六柱層析

ColumnChromatogrphy

常壓柱層析(0.1~50g)

（OrdinaryColumnChromatogr.）

吸附性柱色譜

分配性柱色譜植物有效

柱色譜離子交換柱色譜成分分離

凝膠過(guò)濾柱色譜主要手段聚酰胺柱色譜大孔吸附樹(shù)脂第16頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、吸附性柱層析

Al2O3orSilicagel

生物堿水溶性

Al2O3

甾體脂溶性Silicagel

揮發(fā)油脂溶性

1裝柱

Al2O3：吸附劑:樣品(20~50:1)(20~100:1)Silica：吸附劑:樣品(30~100:1)(300~400:1)1)干法與TLC吻合度較好，溶劑消耗少

2)濕法緊密，前沿整齊

第17頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2上樣

1)濕法溶劑溶解上樣（少量），低極性

2)干法低極性溶劑溶解性差

3洗脫常壓低壓梯度洗脫

4收集與檢查

等份

TLCUV第18頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、聚酰胺（Polyamide）

1原理

a氫鍵吸附原理酰胺鍵

酚類(lèi)、酸類(lèi)、醌類(lèi)、硝基化合物成氫鍵能力與溶劑有關(guān)水<甲醇<乙醇<丙酮<稀氨液<稀NaOH

氫鍵吸附規(guī)律：基團(tuán)多少；基團(tuán)位置；芳香核，共軛雙鍵；分子內(nèi)氫鍵

b極性吸附原理非極性脂肪鏈

萜類(lèi)、甾體、生物堿

黃酮苷與苷元非水（正相）含水（反相）第19頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2聚酰胺粉的制備國(guó)產(chǎn)（15~30目）層析用（80~100目）

粗粉蒸餾水浸泡過(guò)夜，磨細(xì)，混懸液直接使用抽濾后，60~80度烘干2~3小時(shí)備用3操作a裝柱細(xì)粉水浸泡裝柱，自然沉降b上樣20~30%水溶液上樣40-60:1c洗脫水含水醇95%醇3%NaOH5%NaOH4再生5%NaOH第20頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、分配性柱層析

1原理利用混合物在兩相互不混溶中分配系數(shù)不同，而達(dá)到分離的一種柱層析方法。分配系數(shù)差異愈大，分離效果愈好。2支持劑

硅膠、硅藻土、纖維粉

3溶劑系統(tǒng)的選擇PC層析選擇4操作a裝柱b上樣c洗脫第21頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、凝膠柱層析（SephadexLH-20）

1葡聚糖凝膠簡(jiǎn)介

由葡聚糖凝膠SephadexG-25交聯(lián)親脂性羥丙基而制備，是同時(shí)具備吸附層析、分配色譜和分子篩功能的獨(dú)特層析介質(zhì)，溶劑系統(tǒng)沒(méi)有限制，包括水相緩沖液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯和各種混合溶劑，大量文獻(xiàn)證明它非常適合于天然產(chǎn)物純化，特別是中草藥有效成分如甙類(lèi)、生物堿、黃酮、蒽醌、內(nèi)酯、帖類(lèi)、甾類(lèi)、多酚的分離。德國(guó)科學(xué)家HansHenke著有SephadexLH-20凝膠色譜分離專(zhuān)著，詳盡敘述了SephadexLH-20在植物化學(xué)研究中的應(yīng)用。第22頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2原理

分子篩：分子的大小和形狀吸附層析：被分離化合物與凝膠間的氫鍵分配層析：被分離化合物在流動(dòng)相（溶劑）和固定相（凝膠）之間的分配

3操作a裝柱洗脫劑溶脹后懸浮液攪拌裝柱b上樣c洗脫

水溶性好水或電解質(zhì)溶液水溶性差醇水或丙酮水極性較小丙酮、氯仿第23頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六d濃縮

視情況而定

e再生洗脫劑平衡有污染：0.2NNaOH---0.5NHCl浸泡水洗凈---平衡保存：50%丙酮水溶液4應(yīng)用實(shí)例例如，SephadexLH-20層析分離川穹里的腺嘌呤，貝母里的腺苷浙貝寧、茄啶，日本附子里的烏頭堿，銀杏黃酮甙，夏枯草中的夏枯草黃酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿銜草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，多種中草藥中的蘆丁蕓香苷，紅花中的槲皮素、蘆丁、山柰酚、紅色素等多種黃酮，麥冬中的麥冬黃酮，鹿蹄草中的兒茶素，紫草中的萘醌、多酚。第24頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六五、離子交換柱層析

1原理利用大分子樹(shù)脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在的交換基團(tuán)而進(jìn)行的交換性柱層析方法。

2影響離子交換的因素

PH值欲交換化合物的性質(zhì)欲交換化合物的濃度溫度交換溶劑交換流速樹(shù)脂用量第25頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3樹(shù)脂的選擇李伯廷書(shū)91頁(yè)

4操作a樹(shù)脂預(yù)處理b裝柱c上樣d交換e洗脫f樹(shù)脂再生5實(shí)際應(yīng)用第26頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六六、大孔吸附樹(shù)脂層析

1大孔吸附樹(shù)脂簡(jiǎn)介

大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)是上世紀(jì)七十年代發(fā)展起來(lái)的一種新工藝，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)。藥液通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附，其中的有效成分吸附在樹(shù)脂上，再經(jīng)洗脫回收，可除掉藥液中雜質(zhì)，是一種純化精制藥的有效方法。非極性吸附樹(shù)脂在吸附藥液中成分時(shí),主要是依靠物理結(jié)構(gòu)（如比表面、孔徑等）起作用，不同的樹(shù)脂有不同的針對(duì)性。其操作的基本程序大多是：提取液－通過(guò)大孔樹(shù)脂－吸附上有效成分的樹(shù)脂－洗脫－洗脫液回收－洗脫液干燥－半成品。該技術(shù)目前已較廣應(yīng)用于新藥的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中,主要用在分離和提純過(guò)程中。2大孔吸附樹(shù)脂的優(yōu)點(diǎn)

經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)處理后，可有效地去除水煎液中大量的糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽、黏液質(zhì)等吸潮成分，有利于多種中藥劑型的生產(chǎn)，增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)還能縮短生產(chǎn)周期,所需設(shè)備簡(jiǎn)單。免去了靜置沉淀、濃縮等耗時(shí)多的工序。第27頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3大孔吸附樹(shù)脂吸附機(jī)理

4影響分離的因素

分子極性大小分子體積PH值樹(shù)脂柱的清洗洗脫液的選擇第28頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六5操作a樹(shù)脂預(yù)處理b裝柱c上樣d洗脫e樹(shù)脂再生

6實(shí)際應(yīng)用

適合中等程度的水溶性化合物中藥、天然色素，從發(fā)酵液中得到抗生素、（青霉素先鋒霉素螺旋霉素）蛋白質(zhì)（胰島素肽系抗生素）功能性食品添加劑（維生素）等聚苯乙烯合成吸附樹(shù)脂吸附含有π電子的化合物如含有苯環(huán)和共軛雙鍵的化合物

甲基丙烯酸甲酯類(lèi)吸附劑吸附含羧基、酯基、氨基、酰胺基等與H可結(jié)合的官能團(tuán)的化合物

第29頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

特殊柱層析

（SpecialColumnChromatogr.）

干柱柱層析

減壓柱層析植物有效成分

特殊柱層析短柱柱色析分離新方法閃式柱色析棒色譜

一、干柱柱層析

1簡(jiǎn)介第30頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2特點(diǎn)

a優(yōu)點(diǎn)

分離效果比濕法裝柱高可用薄層最佳分離條件直接套用對(duì)有熒光或顏色的物質(zhì)，可在紫外燈下將已分離的各層帶分別切開(kāi)，避免常規(guī)液相層析中因流出液收集不當(dāng)而造成的層帶交叉適用于制備性分離設(shè)備簡(jiǎn)單，消耗溶劑少，工時(shí)省，共軛雙鍵；分子內(nèi)氫鍵

b缺點(diǎn)

樣品容量比濕法裝柱小，因此，消耗填充劑量大

第31頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

3原理與薄層層析相同，借顆粒間的孔隙所產(chǎn)生的毛細(xì)作用而展層，因此，可套用薄層條件，分離效果亦相同。干填充劑顆粒的深孔內(nèi)充滿(mǎn)空氣，溶劑和樣品分子很難進(jìn)入顆粒的深孔，吸附與解吸主要在外部表面進(jìn)行?？朔藰悠贩肿佑捎谶M(jìn)出填充劑深孔所造成的擴(kuò)散及傳質(zhì)緩慢，因此其柱效比濕裝柱高。

a種類(lèi)（填充劑）氧化鋁活性III~V吸附層析硅膠活性II~III干柱聚酰胺層析分配層析第32頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六b展開(kāi)劑

多采用混合溶劑

避免溶劑解混產(chǎn)生，影響分離效果解決辦法：搭配極性相差適當(dāng)?shù)娜軇?/p>

如石油醚－乙醚氯仿－乙醇石油醚－乙醇氯仿－甲醇

苯、苯酚等不透過(guò)紫外光的溶劑對(duì)紫外光燈檢出層帶有影響

c分離條件探索

探索和選擇對(duì)樣品分離度最大的填充劑和展開(kāi)劑

薄層層析(最佳分離條件)

同批次第33頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六d樣品容量

1:100~1:300

樣品只能與吸附劑的外部表面接觸

4操作a柱的制備(常用50cm)

聚乙烯薄膜柱玻璃柱

b加樣和展開(kāi)加樣：溶液加樣；拌樣加樣展開(kāi)：

c層帶的定位及分割

第34頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、減壓柱層析（抽柱VacuumLiquidChromatography)

1簡(jiǎn)介

簡(jiǎn)便、實(shí)用、快速的層析方法，其基本原理與吸附層析相同，適用于較大量的制備性分離或提取物的極性分段劃分。（粗分）2操作

G-4垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽濾瓶、減壓泵及分部收集瓶組成。a裝柱b上樣c洗脫d收集第35頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

3注意事項(xiàng)a真空度

20~70mmHg

b洗脫劑極性由小到大梯度遞增

c交叉色帶4應(yīng)用實(shí)例二萜生物堿的分離黃酮類(lèi)化合物的分離

第36頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、短柱柱層析（抽柱VacuumLiquidChromatography)

短柱柱層析在制備量分離方面有獨(dú)到之處，在微量成分的富集上有一定實(shí)用價(jià)值。1短柱層析理論

經(jīng)典色譜理論：柱效隨柱徑的加大而下降，柱子愈長(zhǎng)，分離越好，柱效越高。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，此理論有一定局限性，在實(shí)踐基礎(chǔ)上，提出新的觀點(diǎn)：柱徑加大后，在適當(dāng)條件下柱效反而提高。a適當(dāng)條件：柱徑：3~20cm短粗柱柱長(zhǎng)：5~30cm第37頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六b原因

(1)Knox提出“無(wú)限直徑效應(yīng)”，認(rèn)為柱短，柱徑相對(duì)較粗，層析相對(duì)集中于中部進(jìn)行，消除或減少了“柱壁效應(yīng)”。(2)柱短，可使洗脫液在柱內(nèi)受阻減少，且截面增大，使自然流速大大增加，為采用高細(xì)度吸附劑提供了可能條件。

2層析方法同普通柱層析，不同之處在于采用短粗柱，使用吸附劑粒度細(xì)小，且粒度范圍窄，裝柱應(yīng)盡量均勻。洗脫時(shí)多采用梯度洗脫，對(duì)洗脫劑選擇較嚴(yán)格。

3注意事項(xiàng)a填料、洗脫劑bRf>0.2c預(yù)純化操作第38頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、閃式柱層析（FlashChromatography)

20世紀(jì)700年代后發(fā)展起來(lái)的一種快速柱層析技術(shù)。1簡(jiǎn)介

柱短，分離時(shí)間短，快，分離效率高。閃式硅膠（FlashSicicagel）

進(jìn)口，國(guó)產(chǎn)（山東即墨化學(xué)試劑廠）球型微粒，粒度在40-63um(230-400目)之間（均勻）

加壓層析0.3-1Kg/cm210mg-10g樣品10-15min

第39頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2

操作

與普通柱層析法基本相同。a裝柱：濕法干法（20cm）b上樣：拌樣濕法c洗脫：Rf0.2-0.3加液8-10cm，加壓3實(shí)際應(yīng)用

皂苷、甾體、生物堿、黃酮

第40頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六五、棒色譜（StickChromatography)

1簡(jiǎn)介

與制備型薄層層析原理相同,分離量大。把硅膠、氧化鋁等制成園柱形的棒，下端上樣，上行展開(kāi)而達(dá)到分離目的。（吳鳳鄂）2操作

a制棒b上樣c展開(kāi)引導(dǎo)座－－兩端相通，內(nèi)填層析硅膠展開(kāi)裝置－－層析槽，密封罩d收集3應(yīng)用

生物堿、皂苷、甾醇等第41頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

加壓柱層析

（PressureLiquidChromatogr.）類(lèi)型

低壓柱層析

加壓柱層析中壓柱色析高壓柱色析

優(yōu)點(diǎn)

分離因子a高，故能完成復(fù)雜的分離過(guò)程

a=兩組分的相對(duì)保留時(shí)間之比分離因子是評(píng)價(jià)色譜柱選擇性的一種指標(biāo)第42頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

制備型與分析型的區(qū)別：分析型：不要求樣品回收制備型：要求樣品載量高，因此便要求有特殊的層析裝置和操作系統(tǒng)基本原理1加壓柱層析效果的好壞

Speed分析型制備型ResolutionLoad與Load相關(guān)的因素柱徑柱長(zhǎng)粒度填充劑密度第43頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

2加壓柱層析目的

得出一個(gè)化合物L(fēng)ab.一定純度生產(chǎn)規(guī)?；厥章蕟挝粫r(shí)間內(nèi)分得的化合物量

洗脫液流速快可用更細(xì)的顆粒，分辨率提高避免不穩(wěn)定化合物在開(kāi)口柱上由于長(zhǎng)時(shí)間暴露而導(dǎo)致分解（最大優(yōu)點(diǎn)）第44頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

3分類(lèi)（Classifcaton）

AnalyticalHPLC:ug---<5mgPrep.HPLC:5mg---gmsLow-pressureLC:10mg---1gMedium-pressureLC:100mg---100g

選擇制備型系統(tǒng)要考慮的事

以上各法的極限（適應(yīng)范圍）要分離的樣品量根據(jù)以上條件要求而選用的方法柱大小，固定相，壓力，洗脫劑

經(jīng)驗(yàn)積累第45頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

4操作aTLC探索條件（層析系統(tǒng)選擇）b分析型小試c優(yōu)化條件（超載）d套用優(yōu)化條件（制備）e正式操作f獲得純品g分析鑒定純品h再生柱正相：actone—water—methanol—THF---dichloromethane反相：water---methanol第46頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

5Prep.LC的各種條件的應(yīng)用情況及優(yōu)化aColumn:loading,f,size,columnefficiency,a,K’numberoftheoreticalplates,resolutionbStationaryphase:液—液,固—液,粒度大小硅膠---普通,鍵合相