ExperimentalStudyofQGBIIforPreventionofGlucocorticoid-inducedOsteoporosisonMarkersofBiochemicalandHistomorphologicmeasurementinRatsMajor:OrthopaedicsandTraumatologyofTCMPostgraduate:QiaoYongpingTutor:Prof.ZhangAnzhenABSTRACTObjective:ToinvestigatetheprophylaxiseffectofqianggubaoII(QGBII)onglucocorticoid-inducedosteoporosisinratsbymeasuringbiochemicalmarkersandhistomorphologicmeasurement.Methods:56maleSDratswererandomlydividedintonormalgroup,controlgroup,QBGgroupandGuSongBao(GSB)group,14eachgroup.Theratsincontrol,QGBandGSBgroupsweregivenprednisone(4.5mg/kg),twiceoneweek,andtheratsinQGBandGSBgroupswereadministratedQGBIIandGSBrespectivelyfrombaseline,andtheratsincontrolandnormalgroupsweregivenNSfrombaseline.Theratswerekilledafter8weeksand13weekstomeasurebiochemicalmarkers,takehistomorphologicmeasurementandobservemicroscopicandultrastructureofbone.Results:thelevelsofurinarycalciumandhydroprolineweresignificantlyhigherincontrolgroupthanthoseinotherthreegroups(p<0.05),andtheserumcalciumandphosphatedidn'tshowsignificantlydiffirenceamongallgroups;serumlevelsofBGPandTwerelowerinthecontrolgroupthaninthenormalgroup(p<0.05),andtheabovemarkersintheQGBandGSBgroupswerestatisticalysignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup,andserumAKPweresimilarinallgroups;serumPTHinthecontrolgroupwashigherthanthatinotherthreegroups(p<0.05);theparametersofbonemassandboneformationdecreasedsignificantlyinthecontrolgroupthaninthenormalgroup(p<0.05),andsuchparametersintheQGBandGSBgroupsincreasedstatisticallythanthoseinthecontrolgroup,butnotreachedthevalueofthenormalgroup,thecontrolgroupshowedincreaseofvalueofparameterofboneresorptioncomparedwiththatinthenormalgroupandGSBgroupalsoshowedhighervalueofparametersofboneresorptionthanthatinnormalandQGBgroups;thestructureandultrastructureofboneshowedimprovensignsintheQGBandGSBgroupscomparedwiththoseincontrolgroup.Conclusion:itseemsthatQGBIIispotentiallyeffectiveinpreventingglucocorticoid-inducedosteoporosis,andQGBIImaybepreventglucocorticoid-inducedosteoporosisthroughthefollowingmechanisms:1.topreventthedisordersofcalciummetabolismsoastopreventthesecondaryhyperparathyrodism;2.toincreasethelevelofandrogenswherebytoincreaseboneformationandinhibitboneresorption;3.todecreasetheinhibitonofglucocortioidontheactivityofosteoblastandostecyte.MeSH:composite(tcm)/pharmcolglucocorticoids/adverseeffosteoporosis/tcmther@QGBIIbiochemialmarkershistolomorphologicmeasurementrats強骨寶2號對激素造模骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝影響的生化與組織形態(tài)學研究專業(yè)：中醫(yī)骨傷科學研究生：喬永平導師：張安楨教授中文摘要目的：通過觀察糖皮質(zhì)激素（GlucocortocoidGC）誘導骨質(zhì)疏松模型大鼠骨代謝生化與骨組織形態(tài)學的變化，探討強骨寶2號預防激素性骨質(zhì)疏松癥的作用機制。方法：將56只3月齡雄性SD大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、強骨寶組和骨松寶組，每組14只。模型組、強骨寶組和骨松寶組，灌服醋酸潑尼松（4.5mg/kg），每周2次，同時強骨寶組與骨松寶組的大鼠每天分別灌服強骨寶2號和骨松寶，模型組和正常組每日灌服等劑量的生理鹽水。分別在第8周和第13周，將實驗大鼠處死，進行血尿生化、骨組織形態(tài)計量學、骨組織形態(tài)學光鏡及電鏡觀察。結(jié)果：）。結(jié)論：強骨寶2號能夠有效預防糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型的骨量丟失、改善骨微結(jié)構(gòu)，這種作用可能是通過糾正鈣磷代謝紊亂、增加雄激素和拮抗GC抑制成骨細胞和骨細胞的成骨功能而實現(xiàn)其抗骨質(zhì)疏松的作用。主題詞：復方（中藥）/藥理學糖皮質(zhì)激素/副作用骨質(zhì)疏松/化學誘導骨質(zhì)疏松/藥物作用@強骨寶2號生化指標骨組織形態(tài)學大鼠強骨寶2號對激素造模骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝影響的生化與組織形態(tài)學研究專業(yè)：中醫(yī)骨傷科學研究生：喬永平導師：張安楨教授前言由于具有抗炎、抗毒素、抗變態(tài)反應(yīng)和抗休克等作用，糖皮質(zhì)激素（GC）在臨床上的使用相當廣泛，已成為自身免疫性疾病和過敏性疾病、激素替代等治療中的重要手段。但是超生理劑量的長期使用或間斷大劑量應(yīng)用會引起全身明顯的骨量丟失而引起骨質(zhì)疏松，致使骨折的危險性增加。在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松當中，GC性骨質(zhì)疏松占首位(1)。臨床資料表明,應(yīng)用7.5mg/d劑量的潑尼松，3個月后約50%的患者會出現(xiàn)明顯的骨丟失，12個月后椎骨壓縮性骨折的發(fā)生率約為30%（1,2），且在最初用藥的3-6個月骨丟失的速度最快,并且骨丟失的嚴重程度與外源性糖皮質(zhì)激素的積累量密切相關(guān)(3)。雖然國內(nèi)外學者對GC性骨質(zhì)疏松進行了積極的探討，但其發(fā)病機制還不是很清楚，目前被普遍認可一種機制是：糖皮質(zhì)激素減少腸道對鈣的吸收及抑制腎小管對鈣、磷的重吸收，反饋性地引起高甲狀旁腺素血癥，增加骨吸收，導致骨重建偶聯(lián)失衡，骨量減少。對此癥臨床上用藥也缺乏針對性，目前臨床上用藥主要有鈣制劑、VitD3活性代謝物、性激素、降鈣素、二膦酸鹽等，但存在療效脫逸、高鈣血癥、消化道功能紊亂、誘發(fā)腫瘤等副作用，價格也較昂貴。從80年代以來，國內(nèi)學者對糖皮質(zhì)激素副作用的中醫(yī)藥防治進行了大量的研究，已認識到糖皮質(zhì)激素對機體的影響是多方面的，包括腎虛癥、氣虛癥、痰濕瘀阻等證候，且這些證候之間相互影響，相互作用(4,5)。故從單一證型出發(fā)研制的方藥，不利于在臨床上的推廣應(yīng)用。強骨寶系列方是張安楨教授整理的經(jīng)驗方，其中強骨寶2號主要由淫羊藿、黃芪、鹿角膠、澤瀉、丹參等藥物組成，具有補腎健脾、益氣血、利濕化瘀等功效，在臨床上主要用于治療因使用糖皮質(zhì)激素而引起的胸腰部疼痛，經(jīng)數(shù)年的臨床驗證，證實強骨寶2號對于減輕糖皮質(zhì)激素造成的骨痛具有較好的療效。本課題應(yīng)用醋酸潑尼松造成實驗性大鼠骨質(zhì)疏松模型，旨在觀察強骨寶2號在13周內(nèi)對實驗性骨質(zhì)疏松的影響，主要從生化和骨組織形態(tài)學上對其療效機制進行探討，并依據(jù)實驗結(jié)果分析激素性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制，為強骨寶2號的臨床推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。實驗材料1．實驗動物3月齡健康清潔級雄性SD大鼠56只，體重250-300g，由上海西普爾必凱實驗動物提供，合格證書：醫(yī)動字第02-49-2號；醫(yī)學實驗動物環(huán)境為鼠類實驗室，清潔級，合格證書：23-016.2．藥物所需中藥一次性從福建省中藥材公司購入。將所需中藥合煎，過濾，濃縮至流浸膏，乙醇提取，濾過，回收乙醇，最后濾液加水調(diào)至含生藥量3g/ml，100ml/瓶，分裝，高壓滅菌。骨松寶由貴州富華藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號：ZZ-5269-黔衛(wèi)藥準字（1996）第100079號，使用時配制成0.25g/ml的混懸液。醋酸潑尼松：醋酸潑尼松由上海華聯(lián)制藥生產(chǎn)，滬衛(wèi)藥準字(1995)第017003.T、CT、BGP、PTH、HOP試劑盒由中國原子能科學研究院同位素研究所提供AKP、Ca、P試劑盒由南京建成生物工程研究所提供實驗用普通生化試劑：均由福州市醫(yī)藥采購供應(yīng)站采購4.2德國產(chǎn)Leica-Q550型全自動計算機圖象分析系統(tǒng)4.3德國產(chǎn)Leica-2155型硬組織切片機4.8Kodak膠卷，美國產(chǎn)實驗方法1.動物造模與分組將56只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、強骨寶組和骨松寶組，每組14只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，于每周二和周五7：00am，給予模型組、強骨寶組和骨松寶組的大鼠灌以醋酸潑尼松（4.5mg/kg），每周兩次（周二和周五），正常組大鼠作為對照，同時灌以相應(yīng)劑量的生理鹽水。2.各組大鼠的處理方式各組大鼠處理方式：強骨寶組灌服強骨寶混懸液，骨松寶組灌服骨松寶混懸液，同時給予模型組和正常組的大鼠灌服相同劑量的生理鹽水，各組大鼠都在7

:00pm-8

:00pm給藥。所有大鼠均在室溫為18-20℃，濕度為50-60%的同等條件下飼養(yǎng)，自由攝取水和食物，分別于第8周和第13周將實驗大鼠處死,每次每組處死7只。在處死大鼠前13天和前3天，分別皮下注射鹽酸四環(huán)素（25mg/kg）（因其能鰲合鈣沉積在新形成骨組織的起始點，在骨表面形成雙層熒光，標明兩次標記期間的骨形成的情況）。每次取材前用代謝籠留取24小時尿液，采用斷頭取血法采血，骨骼標本于采血后立即解剖取材固定。3.觀察指標體重指標：每周日7

:00am-8

:00am用電子體重測量儀測體重尿生化指標：尿鈣（U-Ca）用MTB結(jié)合比色法測定；尿磷（U-Pi）用硫酸亞鐵磷鉬藍比色法測定；尿羥脯氨酸（U-HOP）用二甲氨基苯甲醛顯色法測定。血清生化指標：血清鈣（S-Ca）用MTB結(jié)合比色法測定；血清磷（S-Pi）用硫酸亞鐵磷鉬藍比色法測定；血清堿性磷酸酶（AKP）用磷酸苯二鈉法測定。血清骨代謝相關(guān)激素指標：骨鈣素（BGP）、降鈣素（CT）、睪酮（T）、甲狀旁腺激素（PTH）用放免法測定。骨組織形態(tài)學光鏡觀察：大鼠處死后即取第二腰椎和右側(cè)股骨頸，剔凈軟組織，切取大小適宜標本，立即投入10%福爾馬林溶液固定48h，中間換液一次。然后以50%甲酸溶液脫鈣15天后，依次以50%、60%、70%、80%酒精脫水各6小時，90%、95%酒精脫水各1小時，100%酒精脫水兩次，各30min，二甲苯透明兩次，各20min，60℃恒溫下浸蠟4小時，期間換蠟兩次,然后包埋。以輪轉(zhuǎn)式切片機切取8um厚切片，貼片，恒溫37℃烤片一天，HE染色，脫水,透明,封片,觀察皮質(zhì)骨和骨小梁形態(tài)、梁髓比例等。3.6骨組織的計量學測定：將大鼠處死后，取脛骨上1/3段，置于10%磷酸緩沖液配制的福爾馬林溶液中固定24h，然后轉(zhuǎn)入70%酒精內(nèi)固定3天，再80%、90%、95%上行酒精脫水各1天，100%酒精2天，中間換液一次，然后用特殊骨染料(OsteochromeVillanuvaBoneStain,Polysciences,InC.USA)染色3天，然后以50%酒精開始按上述的脫水步驟逐級脫水，標本投入純丙酮中脫脂48小時，中間換液一次，然后入二甲苯中透明兩次，最后用甲基丙烯酸甲脂包埋不脫鈣骨，用硬質(zhì)切片機制成20um厚的切片，再次脫水、透明后封片，觀察并計算骨組織靜態(tài)參數(shù)：骨小梁的面積，骨小梁的厚度，骨小梁的數(shù)量，骨小梁的間隙；骨組織的動態(tài)參數(shù)：骨礦化沉積率，熒光標記周長、骨形成率，破骨細胞吸收表面周長。3.7透射電鏡觀察：取第三腰椎，切取1mm3大小骨塊，迅速將樣品投入5%戊二醛+4%多聚甲醛+0.1M磷酸緩沖液(PH=7.2)配制的溶液中進行前固定數(shù)日。再以5.5%EDTA+2.5%戊二醛+2%多聚甲醛(PH=7.2)溶液于4℃冰箱中脫鈣3周，脫鈣后組織塊以0.1M磷酸鹽緩沖液(PH=7.2)漂洗3次，每次10分鐘。然后再以1%四氧化鋨+1.5%亞鐵氫化鉀(1:1)溶液于4℃下進行后固定2小時，再次以0.1M磷酸鹽緩沖液漂洗3次。然后入50%酒精10分鐘→70%酒精＋飽和醋酸鈾溶液(4℃、過夜)→90%酒精10分鐘→90%酒精＋90%丙酮(1:1)10分鐘→90%丙酮10分鐘→100%丙酮10分鐘×3次系列脫水。脫水后組織塊以100%丙酮＋包埋劑(1:1)室溫下浸透1.5小時，再以100%丙酮＋包埋劑(1:3)室溫下浸透2.5小時，然后入包埋劑35℃下過夜。再進入包埋劑聚合，35℃下12小時、45℃下12小時、60℃下60小時。然后制成1um厚的半薄切片，進行美蘭－天青Ⅱ液染色后定位，再切成700-900A超薄切片經(jīng)鈾鉛電子染色后上銅網(wǎng)，于HU-12A電子顯微鏡下觀察骨細胞、成骨細胞、破骨細胞及骨基質(zhì)等的超微結(jié)構(gòu)。所有數(shù)據(jù)采用eq\o(\s\up13(—),x)±s表示，多組之間進行F檢驗，并用q檢驗進行組間的兩兩比較，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件包進行處理。結(jié)果1.實驗大鼠一般情況實驗過程中，各組大鼠的體重沒有明顯差異性變化，模型組實驗大鼠除了精神萎靡、活動少外，體毛光澤度、飲水及攝入飼料的量與其它各組大鼠相當。2.各組第8組和第13周血尿鈣磷值的比較（見表1和表2）表1第8周各組血鈣（S-Ca）、血磷（S-Pi）、尿鈣（U-Ca）和尿磷（U-Pi）值的比較nS-Ca（mmol/L）S-Pi（mg/dl）U-Ca（mg/24h）U-Pi（mg/24h）正常組7±±±±模型組7±±±1）±骨松寶組7±±±2）±強骨寶組7±±±2）±FSig注：1);2)上表顯示：經(jīng)F檢驗，各組S-Ca、S-Pi和U-Pi三項指標差異性不顯著，U-Ca值四組間有顯著差異，再經(jīng)q檢驗顯示模型組的U-Ca顯著高于正常組（p<0.05）,強骨寶組和骨松寶組的U-Ca則顯著低于模型組(p<0.05)。表2第13周各組血鈣（S-Ca）、血磷（S-Pi）、尿鈣（U-Ca）和尿磷（U-Pi）值的比較NS-Ca（mmol/L）S-Pi（mg/dl）U-Ca（mg/24h）U-Pi（mg/24h）正常組7±±±±模型組7±±±1）±骨松寶組7±±±2）±強骨寶組7±±±2）±Fsig注：1);2)上表顯示：第13周各組之間的血鈣磷及尿磷的變化基本同第8周，總體上四組的差異不明顯，再經(jīng)q檢驗，模型組的U-Ca值高于其它三組，差異顯著（p<0.05），強骨寶組和骨松寶組的U-Ca與正常組相比無顯著性差異（p>0.05）。3.各組BGP、AKP和HOP的比較（見表3和表4）表3第8周各組BGP、AKP和HOP的比較NBGP（ng/ml）AKP（金氏單位/ml）HOP（ug/24h）正常組7±±±模型組7±1）±±1）骨松寶組7±1）2）±±2）強骨寶組7±1）2）±±2）FSig注：1）表示與正常組相比p<0.05;2)表示與模型組相比p<0.05)上表顯示：經(jīng)F檢驗,四組之間骨鈣素(BGP)和羥脯氨酸（HOP）兩項指標差異顯著,在F檢驗的基礎(chǔ)上經(jīng)q檢驗顯示：模型組的血清BGP顯著低于正常組(p<0.05),骨松寶組和強骨寶組的BGP明顯高于模型組(p<0.05),但低于正常對照組(p<0.05);模型組的尿羥脯氨酸(HOP)顯著高于其它三組(p<0.05)，并且后三者之間無顯著差異（p>0.05）;各組之間的堿性磷酸酶(AKP)值沒有顯著差異（p>0.05）。表4第13周各組BGP、AKP和HOP的比較nBGP（ng/ml）AKP（金氏單位/ml）HOP（ug/24h）正常組7±±±模型組7±1）±±1）骨松寶組7±1）2）±±2）強骨寶組7±1）2）±±2）Fsig

上表顯示:第13周,總體上四組之間的BGP差異非常顯著(F=,p<0.001),經(jīng)q檢驗,模型組的BGP明顯低于其它三組(p<0.05),骨松寶組和強骨寶組的BGP仍低于正常組(p<0.05);總體上四組的HOP變化也較顯著(F=7),經(jīng)q檢驗模型組的HOP顯著高于另外三組(p<0.05);各組之間的AKP仍無顯著變化（p>0.05）。4.表5第8周各組CT、T和PTH變化的比較nCT（pg/ml）T（ng/dl）PTH（ng/dl）正常組7±±±模型組7±±1)±1)骨松寶組7±±2)±2)強骨寶組7±±2)±2)Fsig上表顯示:總體上四組之間的T和PTH的差異非常顯著（F=，p=；F=3））,與正常組差異不顯著（p>0.05）;各組之間的CT無明顯差異(p>0.05)。表6第13周各組CT、T和PTH值的比較nCT（pg/ml）T（ng/dl）PTH（ng/dl）正常組7±±±模型組7±±1)±1)骨松寶組7±±2)±2)強骨寶組7±±2)±2)Fsig上表顯示:各組之間的CT、T和PTH的變化基本同第8周，經(jīng)F檢驗與q檢驗顯示：模型組T值明顯低于其它三組(p<0.05)，后三者之間無顯著差異（p>0.05）;模型組的PTH顯著高于另外三組(p<0.05),后三組之間的PTH無顯著差異（p>0.05）;各組之間的CT仍無顯著差異（p>0.05）。（表7和表8)。表7第8周脛骨上段松質(zhì)骨骨計量學動靜態(tài)參數(shù)測量值的比較(eq\o(\s\up13(-),X)±S)正常組模型組骨松寶組強骨寶組Fsign7777骨小梁面積百分率（Tb.Ar%）±±1）±2）±2）骨小梁厚度（Tb.Thum）±±±±骨小梁數(shù)量（Tb.No個/mm）±±1）±2）±2）骨小梁分離度（Tb.Spum）±±1）±2）±2）熒光標記周長百分率（Lb.Pm%）±±1）±2）±2）礦化沉積率（MARum/d）±±1）±2）±2）骨形成率（BFR/TV%/y）±±1）±1）2）±1）2）破骨細胞吸收表面周長百分率（OC.Sur%）±±±±上表顯示：經(jīng)F檢驗，各組間的骨小梁厚度和反映骨吸收的破骨細胞吸收表面周長百分率(OC.Sur)無明顯差異，其余各項指標有顯著差異，經(jīng)q檢驗結(jié)果如下：模型組的代表骨量的骨小梁面積（Ar.Tb）百分率、骨小梁數(shù)量（Tb.No）參數(shù)值顯著低于其它三組（p<0.05）,骨小梁間隙（Tb.Sp）參數(shù)值顯著高于另外三組(p<0.05)，熒光標記周長(Lb.Pm)百分率、礦化沉積率（MAR）和骨形成率(BFR/TV)等反映骨形成的參數(shù)值顯著低于正常對照組（p<0.05）,骨松寶組和強骨寶組的Lb.Pm、MAR、BFR/TV則明顯高于模型組（p<0.05），但BFR/TV則低于正常組（p<0.05）。表8第1正常組模型組骨松寶組強骨寶組Fsign7777骨小梁面積百分率(Tb.Ar%)±±1)±1)2)±1)2)骨小梁厚度（Tb.Thum）±±1)±2)±2)骨小梁數(shù)量(Tb.No個/mm)±±1)±2)±2)骨小梁分離度（Tb.Spum）±±1)±2)±2)熒光標記周長百分率（Lb.Pm%）±±1)±2)±2)礦化沉積率（MARum/d）±±1)±2)±2)骨形成率(BFR/TV%/y)±±1)±1)2)±2.541)2)破骨細胞吸收表面周長百分率(OC.Sur%)±±1)1.15±1)±2)3)）；第13周模型組和骨松寶組的破骨細胞吸收表面周長百分率（OC.Sur）則顯著高于正常組和強骨寶組（p<0.05），強骨寶組的OC.Sur與正常組相比差異不顯著（p>0.05）。附不脫鈣骨四環(huán)素熒光攝影照片(見照片1-4)5.各組骨組織形態(tài)的光學顯微鏡觀察結(jié)果比較各組的股骨頸的皮質(zhì)骨厚度沒有出現(xiàn)明顯的不同(照片5-8)。第8周后，與正常組相比,模型組的腰椎骨小梁數(shù)量減少，髓腔擴大，偶可見小梁穿孔現(xiàn)象(照片9-10),強骨寶組和骨松寶組的小梁骨結(jié)構(gòu)與正常組大致相同(照片11-12)；第13周后，與正常組相比，模型組骨小梁的數(shù)量顯著減少、髓腔擴大、小梁厚度明顯變薄，許多骨小梁出現(xiàn)穿孔、斷裂現(xiàn)象（照片13）。與模型組相比，強骨寶組的髓腔與骨小梁的比例有減少的趨勢，骨小梁的數(shù)目增加，小梁的厚度增加，也可見骨小梁穿孔的現(xiàn)象，但視野下穿孔的數(shù)量少于模型組（照片14）。骨松寶組的小梁骨結(jié)構(gòu)觀察同強骨寶組的情況大致相似（照片15）,總體上觀察，強骨寶組和骨松寶組的髓腔與小梁的比例仍比正常組大。正常組腰椎松質(zhì)骨主要可觀察到下列幾種骨細胞:成骨相骨細胞，胞體較大，胞漿內(nèi)具有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和大的高爾基體，細胞體和骨陷窩之間的空間較小,細胞周圍可見大量新生的膠原纖維(照片16);早期吸收相骨細胞，細胞體變小，核漿比例變大，細胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較成骨相骨細胞明顯減少，胞漿內(nèi)可見囊泡結(jié)構(gòu),骨陷窩相對擴大,陷窩邊緣及骨小管壁出現(xiàn)細薄的嗜鋨板層(照片17)。模型組的標本主要見到下列骨細胞：晚期吸收相骨細胞,胞體較小，核漿比例較成骨相骨細胞明顯增大，胞漿中細胞器較少，有的胞膜幾乎貼附于細胞核的表面,僅見固縮的胞體內(nèi)有少量的類似細胞突起的結(jié)構(gòu)與陷窩壁接觸,骨陷窩和骨小管的嗜鋨板層厚而清晰（照片18）；退變相骨細胞，細胞器已無法辨認，有的細胞開始裂解，骨陷窩可見清晰而厚的嗜鋨板層及絮狀物質(zhì)（照片19）；已經(jīng)死亡的骨細胞，骨陷窩內(nèi)除了偶爾可見的殘骸外，基本上成為空蕩的骨陷窩。在小梁骨表面偶見鄒褶緣清晰，多核的破骨細胞（照片20）。在本組標本中,大多數(shù)為退變相的骨細胞,其次是晚期吸收相和死亡的骨細胞.骨松寶組的標本中可見下列幾類骨細胞：成骨相骨細胞，胞漿豐富，核漿比例相對較小，胞漿內(nèi)充滿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及許多大的高爾基體，線粒體量多,嵴清晰可見；吸收相骨細胞，核漿比例縮小，細胞器減少，可見小量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其周圍的高爾基體，胞漿內(nèi)見散在的囊泡狀結(jié)構(gòu)，在陷窩邊緣出現(xiàn)絮狀物質(zhì)和嗜鋨板層；退變相骨細胞，胞體核漿比例進一步增大，胞漿較小，骨陷窩明顯擴大,骨陷窩內(nèi)的細胞固縮、裂解。強骨寶組標本所見骨系細胞如下：具有分泌特征的成骨細胞，細胞位于骨質(zhì)邊緣靠髓腔側(cè)，胞體較狹長，約數(shù)倍于骨細胞的胞體，核漿比例顯著小于骨細胞，胞漿內(nèi)可見大量池狀的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及充斥在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍的大高爾基體(照片21)；成骨相的骨細胞，位于骨陷窩中，胞體飽滿,具有分泌型細胞的特征，即胞漿豐富，有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體；吸收相的骨細胞，胞漿減少，核漿比例變大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器減少，出現(xiàn)許多囊泡狀結(jié)構(gòu),骨陷窩明顯增大,出現(xiàn)嗜鋨板層。本組的特點是：可見到成骨細胞，成骨相與吸收相2個階段的骨細胞，比例相當。討論1.糖皮質(zhì)激素（GC）性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制鈣磷代謝紊亂與GC性骨質(zhì)疏松的關(guān)系鈣磷的重要性在于：保持骨骼的完整性，維持機體多種正常的生理功能。人體內(nèi)的99%的鈣和85%的磷以羥磷灰石晶體的形式存在骨骼中（6）。鈣磷重要性的保持有賴于細胞外液的鈣磷離子濃度的恒定，而骨組織是血清中鈣磷的主要調(diào)節(jié)來源。本實驗結(jié)果顯示，GC能夠顯著增加尿鈣的排出，血清鈣、磷的水平與正常組沒有明顯差異，本實驗結(jié)果提示GC至少影響了機體的鈣代謝，即GC增加了鈣的排出量。雖然準確監(jiān)控大鼠由腸吸收的鈣含量比較困難的，但本實驗大鼠所食用的飼料為同一批飼料，并且每日所食用的飼料和飲水量相當，也就是說單純從飲食來源的角度來說，各組的大鼠的鈣入量是大致相同的，實驗中各組的血鈣水平未出現(xiàn)明顯差異性變化，說明已排除GC造成高血鈣導致尿鈣增加的可能，并且已有實驗證實GC能夠通過減少小腸粘膜鈣結(jié)合蛋白（CaBP）的合成而減少腸鈣吸收（7）。由此可見，GC能夠通過直接減少鈣的入量及增加鈣的出量，形成負鈣平衡。1,25-(OH)2D3是重要的調(diào)鈣激素,小腸粘膜上皮細胞上具有1,25-(OH)2D3受體,通過受體介導作用促進小腸對鈣的吸收,增加腎小管對鈣的重吸收（8），在基礎(chǔ)實驗中已證實GC可明顯降低血中的1,25-(OH)2D3的水平（9），從而通過1,25-(OH)2D3的途徑間接減少鈣的入量、增加出量，造成鈣代謝的負平衡。磷的代謝相對于鈣來說，比較復雜，易受不同群體、不同飲食習慣、不同體力活動、不同PH值影響（10），因此GC對磷的影響就不如對鈣的影響明顯，本實驗中尿磷雖有增加的趨勢，但并無統(tǒng)計學意義。目前認為GC對骨代謝影響的重要機制之一是通過減少腸鈣吸收、減少腎小管對鈣的重吸收而增加尿鈣的排泄，造成負鈣平衡（11），機體調(diào)動各種調(diào)鈣機制（包括下面要討論的繼發(fā)性PTH分泌增加）犧牲骨組織的鈣，從而維持細胞外液鈣離子濃度恒定以供機體整體對鈣的需求，這與本實驗結(jié)果所提示的結(jié)論是一致的。因此單從骨鈣代謝的角度來說，GC增加了骨鈣的釋放，從而加速礦物質(zhì)的丟失。1.2繼發(fā)性高甲狀旁腺素（PTH）血癥與GC性骨質(zhì)疏松骨組織中的骨細胞、成骨細胞和破骨細胞都是PTH的靶細胞，PTH對骨代謝的主要影響是增強破骨細胞的活性，抑制成骨細胞的功能，從而加強骨細胞性骨吸收和破骨細胞性骨吸收（12），釋放骨中的鈣進入血循環(huán)中，以供機體對鈣的需求。細胞外液的鈣離子的濃度是調(diào)節(jié)PTH合成和分泌的主要因素，即使血清中鈣離子出現(xiàn)微小的變化，PTH也比較敏感：血鈣降低時PTH分泌增加，血鈣升高時PTH分泌下降（13）。此外,PTH還能通過成骨細胞膜上的PTH受體，以cAMP為第二信使，抑制堿性磷酸酶的活性以及膠原蛋白和骨鈣素的分泌（14），從而減少骨基質(zhì)的形成。糖皮質(zhì)激素通過抑制小腸鈣轉(zhuǎn)運蛋白，減少腸鈣吸收，減少腎小管對鈣重吸收，導致血鈣下降，反饋性地引起甲狀旁腺激素合成、分泌增加（11,15）。另外GC可直接刺激甲狀旁腺細胞分泌更多的PTH（16），已有實驗證實，在離體器官培養(yǎng)中，加入GC后甲狀旁腺培養(yǎng)基中的PTH顯著增加（17）。GC引起血中PTH升高，進而增加骨吸收，造成骨量減少，是目前被普遍接受的GC性骨質(zhì)疏松癥的致病機制，但尚不能斷定此過程是造成GC性骨質(zhì)疏松的主要機制，因為GC誘導的骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為骨形成的抑制，屬于骨代謝低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥,并且松質(zhì)骨丟失較皮質(zhì)骨嚴重（18，19）,而PTH主要是促進骨吸收,高PTH造成的骨質(zhì)疏松屬于骨代謝高轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松，并且過量的PTH造成骨丟失主要發(fā)生在外周皮質(zhì)骨(20,21)。本實驗第8周的骨計量學檢測顯示模型組骨形成參數(shù)減低，代表骨吸收的參數(shù)未受影響，實驗結(jié)果表明至少在早期GC對骨組織的主要影響是抑制骨形成。因此，GC除了通過繼發(fā)高甲狀旁腺激素血癥導致骨丟失外，還存在其它重要的作用途徑。1.3睪酮（T）減少與GC性骨質(zhì)疏松性激素(sexhormone)在骨重建中對于維持骨吸收和骨形成的平衡具有重要的作用，體內(nèi)性激素水平下降對骨代謝有重要影響。AlirezaFalahati-Nini等人對用性激素抑制劑造成雌激素、雄激素缺乏的患者進行臨床觀察時發(fā)現(xiàn)，當二者都缺乏時，骨吸收指標增加，并且雌激素和雄激素缺乏都能使骨形成生化指標降低（22）。體外試驗顯示雄激素能夠直接抑制分離培養(yǎng)的破骨細胞的活性（23），并且還能抑制骨髓干細胞和成熟的成骨細胞產(chǎn)生IL-6（一種促骨吸收的細胞因子）（24）。Vanderschueren等人在動物實驗中發(fā)現(xiàn)雄激素能夠有效地預防年老雄性或去卵巢大鼠的骨丟失（25,26）。雄激素對骨代謝的影響可能是通過受體介導作用實現(xiàn)的，Colvard等人證實體外培養(yǎng)的人骨細胞上有雄激素受體的表達（27）。雄激素還可以抑制PTH對成骨細胞的作用，并且抑制成骨細胞合成前列腺素（PEG）（28,29），從而間接抑制骨吸收。雄激素還具有促進蛋白質(zhì)合成的作用，通過誘導I型膠原合成而刺激骨形成（30）。臨床研究證實外源性的GC能夠抑制下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA軸）的功能，從而抑制腎上腺皮質(zhì)分泌睪酮的功能（31）。動物實驗證實GC還能夠通過對睪丸的直接作用抑制睪酮的分泌（32）。本實驗模型對照組中的睪酮與正常組相比，顯著降低，并且同期骨組織形態(tài)計量學中的骨量參數(shù)也顯著低于正常組，提示本實驗中睪酮的下降可能是GC導致骨量丟失的原因之一。由此可見GC造成骨量丟失的作用途徑之一，可能是通過減少性激素的合成和分泌，抑制骨形成，增加骨吸收，造成骨代謝的負平衡。1.4降鈣素(CT)與GC性骨質(zhì)疏松內(nèi)源性CT是由甲狀腺濾泡旁細胞分泌的，破骨細胞具有CT受體。降鈣素對骨組織代謝的主要影響是通過cAMP介導作用，抑制破骨細胞的活動性，使破骨細胞不能附著在骨的表面，從而抑制其骨吸收的功能（33），此外CT還能抑制骨細胞性骨吸收。血清中鈣離子的濃度是CT合成和分泌的主要調(diào)節(jié)因素（34）。有許多研究結(jié)果顯示GC能降低CT的水平，認為CT降低也可能是GC致骨量減少的原因之一（35）。但本實驗模型組的降鈣素水平?jīng)]有明顯降低，與上述結(jié)果不一致，這種情況的出現(xiàn)，可能和CT的調(diào)節(jié)機制有關(guān)，降鈣素主要受血清鈣離子的水平調(diào)節(jié)，血鈣升高時，CT升高，血鈣降低時，CT也出現(xiàn)一定程度的降低，本實驗各組中的血鈣水平?jīng)]有明顯差異，CT相應(yīng)地保持穩(wěn)定的狀態(tài)。至于GC是否能直接影響甲狀腺合成、分泌CT的功能，尚需進一步研究。1.5.GC對骨組織細胞受體介導作用在正常情況下，人體骨代謝處于骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡的狀態(tài)：即骨重建激活→骨吸收→骨形成的過程（A→R→F）。骨吸收主要由破骨細胞來完成，骨形成主要由成骨細胞完成，當成骨細胞完成骨基質(zhì)的合成和鈣化后，深埋于骨基質(zhì)中的成骨細胞的最終結(jié)局是演變?yōu)楣羌毎?。新形成的骨細胞具有成骨細胞特征，具有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及大的高爾基體，在某些因素的刺激下，骨細胞既可發(fā)生骨細胞性溶骨，又可分泌基質(zhì)，進行成骨作用（36）。實驗研究證實人成骨細胞和骨細胞具有GC受體，GC能夠通過受體介導作用影響成骨細胞和骨細胞的功能，誘導骨細胞和成骨細胞的調(diào)亡（37），并且GC還可以減少成骨細胞的活性期（38），從而抑制骨形成。本實驗模型組骨組織的超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，骨細胞大多為吸收相和退變相的骨細胞和空的骨陷窩，提示在GC的作用下，骨細胞主要起到了溶骨性的功能，空骨陷窩的增多可能是GC加速骨細胞退變及誘導骨細胞凋亡的結(jié)果。人破骨細胞是否具有GC受體，目前尚不能肯定，不過黃琳等人在離體培養(yǎng)的實驗研究中發(fā)現(xiàn)骨巨細胞瘤中破骨細胞樣多核細胞GC受體mRAN的表達，提示人破骨細胞很可能存在GC受體（39）,由于人破骨細胞很難在體外培養(yǎng)獲得，因此要證實人破骨細胞GC受體的存在以及GC對破骨細胞具體發(fā)揮什么樣的作用，尚需進一步深入的研究。綜上所述，GC導致骨丟失的主要機制可以歸納為三點：1.通過繼發(fā)性高PTH血癥增加骨吸收；2.通過抑制雄激素的合成和分泌，間接抑制骨形成，促進骨吸收；3.通過受體介導抑制成骨細胞和具有成骨能力的骨細胞的功能，減少骨形成。根據(jù)臨床癥狀，骨質(zhì)疏松可歸為中醫(yī)的“骨痿”“骨痹”、“腰背痛”的范疇。祖國醫(yī)學認為骨骼是人體的支架，其內(nèi)有腔隙，藏骨髓?！端貑?應(yīng)象大論》明確地說“腎生骨髓，腎精充足，則骨髓生化有源”，說明人體的骨骼依賴骨髓的營養(yǎng)，骨髓為腎精所化生，腎與骨的生長、發(fā)育、修復密切相關(guān)。各種病理因素及年老體衰致腎氣衰弱，則腎不生髓，骨失所養(yǎng)，骨質(zhì)脆弱，正如《素問.生氣通天論》所謂“腎氣乃傷，高骨乃壞”?！毒霸廊珪?痿癥》云“腎者，水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”，所述的“骨枯而髓虛，故足不任身”正是骨質(zhì)減少，骨質(zhì)脆弱等骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)，說明骨質(zhì)疏松的發(fā)病根源在腎。在“腎主骨”的理論指導下，在臨床上和基礎(chǔ)實驗中，應(yīng)用補腎中藥防治骨質(zhì)疏松，在減輕疼痛、增加骨量及骨密度方面，具有較好的療效（40）。關(guān)于GC性骨質(zhì)疏松癥，祖國醫(yī)學無本病記載，是隨著近代藥源性疾病的出現(xiàn)而逐步深入研究的。GC性骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)與原發(fā)性骨質(zhì)疏松的臨床表現(xiàn)基本一致，表現(xiàn)為腰背及全身骨骼疼痛，骨質(zhì)脆弱，易發(fā)骨折等，組織形態(tài)學上表現(xiàn)為骨量減少，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁減少，變細，骨髓腔擴大。根據(jù)臨床表現(xiàn)及“腎主骨”的理論，GC性骨質(zhì)疏松癥仍然以腎虛證為本，并且從腎論治也具有較好的療效，在動物實驗中已證實補腎方藥能夠增加GC致骨質(zhì)疏松大鼠的骨量和骨形成的代謝參數(shù)（41）。長期使用GC時可產(chǎn)生眾多的副作用，而這些副作用表現(xiàn)出來的中醫(yī)證候也不盡相同。GC長期應(yīng)用或間斷大劑量應(yīng)用可以導致高脂血癥，髓腔脂肪填塞、血管內(nèi)脂肪栓塞等副作用，這也是造成激素性股骨頭壞死的重要的病理機制（42，43），從微觀辨證的角度上分析，屬于中醫(yī)的“痰濕淤阻”、“淤血證”等范疇（44），并且有實驗證實，活血化瘀為主的方藥，能夠明顯增加骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨量（45）。由于GC產(chǎn)生的副作用范圍較廣，其誘導骨質(zhì)疏松癥所表現(xiàn)出來的證也是多方面的，不同于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，因此我們推測如果在中醫(yī)的辨證論治的理論指導下，以補腎為主，兼顧益氣活血、利濕化痰的治則治法去組方，防治效果是否會更好，這也是本實驗所要驗證的問題之一。本實驗所用的強骨寶2號是以GC所致的副作用為組方出發(fā)點，以淫羊藿、黃芪為主藥，以鹿角膠、骨碎補、澤瀉、丹參、蒼術(shù)為輔，佐以牡蠣等藥，標本兼顧，具有補腎健脾，益氣活血，利濕化痰的功效，在臨床上主要用于治療長期應(yīng)用GC治療所致的骨質(zhì)疏松，對于減輕疼痛，增加骨密度具有較好的療效。3.動物模型的建立世界衛(wèi)生組織制定的骨質(zhì)疏松診斷標準是：女性的骨密度如果比同性別的正常年輕人的平均骨密度減少2.5個標準差，男性的骨密度比同性別正常年輕人低3個標準差，則骨質(zhì)疏松癥可以成立。但這個標準主要是針對白種人而言的，是否適用于其它種族及動物模型還存在較大爭議（46），目前很難確定動物骨質(zhì)疏松的標準，從目前的已報道的文獻來看，大部分骨質(zhì)疏松的動物模型標準為骨密度下降、骨量減少或骨強度降低具有統(tǒng)計學意義，就可認為實驗動物已形成骨質(zhì)疏松。本實驗著重從骨量以及決定骨強度的骨顯微結(jié)構(gòu)的變化來判斷模型的成功與否。目前主要用醋酸潑尼松、氫化潑尼松和地塞米松制造GC性骨質(zhì)疏松的動物模型，文獻報道的造模方法主要有：應(yīng)用醋酸潑尼松4.5mg/kg灌胃，每周2次，三個月就可顯著減少實驗大鼠的骨量，降低骨強度（47）；用氫化潑尼松4.5mg/kg肌注，每周2次，共8周，即可顯著減少骨量（48）；用地塞米松1mg/kg肌注，每周2次，共5周，組織形態(tài)劑量學測量即可顯示骨量及骨形成參數(shù)下降，骨吸收參數(shù)升高（49）。應(yīng)用灌服醋酸潑尼松建立GC性骨質(zhì)疏松模型是有廣東醫(yī)學院骨生物研究室李青南等人建立的方法（47），操作相對簡單，可重復性強，本實驗就是采用此種造模方法。第8周與第13周實驗結(jié)果顯示模型組的骨量減少、骨形成指數(shù)下降、骨吸收指數(shù)升高，并且都有統(tǒng)計學意義。本實驗分第8周和第13周兩次檢測，目的是觀察在早期是否也可以出現(xiàn)骨量的明顯丟失。實驗結(jié)果證實在第8周骨小梁數(shù)目減少，并可見許多小梁發(fā)生斷裂現(xiàn)象，這比李青南（47）等人的實驗結(jié)果在時間上提前4周，并且實驗中還發(fā)現(xiàn)，第8周時骨小梁的寬度沒有發(fā)生明顯變化，但第13周模型組的骨小梁的寬度指數(shù)較正常組顯著減少，提示隨著糖皮質(zhì)激素量的積累，不但骨小梁數(shù)量發(fā)生變化，而且骨小梁的結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)變細等異常變化。第8周時模型組的骨形成指標顯著低于正常組，而骨吸收指標則無顯著差異，第13周后，骨吸收指標也顯著升高，提示GC對骨代謝的影響主要是抑制骨形成，隨著GC量的積累，骨吸收也逐漸增強。綜合骨代謝生化指標、骨組織形態(tài)學光鏡及電鏡的結(jié)構(gòu)觀察以及骨組織形態(tài)計量學檢測的結(jié)果，本實驗的動物模型的建立是成功的。4.強骨寶2號和骨松寶對GC骨質(zhì)疏松模型骨代謝指標的影響4.1.對鈣（Ca）代謝的影響實驗結(jié)果顯示強骨寶組和骨松寶組的尿鈣顯著低于模型組，提示強骨寶2號和骨松寶減少了GC所致的鈣排出增加的狀況。尿鈣的降低可能有兩種情況；血鈣水平的降低，相應(yīng)地經(jīng)腎排出也減少；腎小管對鈣的重吸收增加。血清鈣的檢測結(jié)果顯示強骨寶組和骨松寶組的血鈣與模型組差別不明顯，排除了因低血鈣所致的代償性低鈣尿，因此強骨寶2號減少尿鈣的最大可能原因是增加了腎小管對鈣的重吸收的能力。從實驗結(jié)果的變化情況我們可以推測強骨寶2號可能通過拮抗GC減少腎小管重吸收鈣磷的作用，阻止繼發(fā)性高PTH血癥的發(fā)生，從而間接減少由高PTH引起的過度骨吸收。4.2.對堿性磷酸酶（AKP）、骨鈣素（BGP）和尿羥脯氨酸（HOP）的影響AKP和BGP都是由成骨細胞分泌的非膠原蛋白，兩者對Ca+2和羥基磷灰石具有很強的親和力，能夠啟動和加速骨基質(zhì)的鈣化，其中BGP是骨形成的特異性指標，并能夠維持骨的正常礦化速率，血清中的BGP水平與骨組織中的水平成正相關(guān)（50,51）。HOP是骨基質(zhì)I型膠原的分解產(chǎn)物，經(jīng)腎排泄，是反映骨吸收的有效生化指標。實驗結(jié)果顯示模型組的BGP在第8周和第13周都低于正常組，強骨寶組和骨松寶組的BGP要明顯高于模型組，但未達到正常組的水平。模型組的HOP從第8周開始就明顯低于其它三組，強骨寶組與骨松寶組的尿HOP含量與正常組相比無明顯差異。各組血清AKP未出現(xiàn)明顯差異，這與BGP出現(xiàn)顯著性差異的結(jié)果不一致，可能由于血清總AKP作為反映骨代謝的生化指標缺乏特異性的緣故。強骨寶2號升高骨質(zhì)疏松模型的BGP，說明了強骨寶2號能夠增強成骨細胞的活性，拮抗GC對骨形成的抑制；HOP的降低以及尿鈣的減少，提示強骨寶2號具有減少GC增加骨吸收的作用。4.3.對PTH和CT的影響強骨寶組和骨松寶組的PTH顯著低于模型組，與正常組相比沒有顯著性差異，強骨寶2號能夠降低GC所致的高PTH可能有兩方面的原因：一是強骨寶2號在應(yīng)用GC的早期就糾正了鈣的負平衡，阻止了繼發(fā)性高PTH血癥的發(fā)生；另一方面的原因可能是強骨寶2號抑制GC對甲狀旁腺的直接刺激，減少PTH的過多分泌。PTH的降低，意味著強骨寶2號可以通過阻止繼發(fā)性高PTH血癥，從而減少PTH所致的骨丟失。各組中CT未出現(xiàn)明顯差異的原因在GC性骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中已討論過，可能是由于細胞外液鈣離處于動態(tài)平衡，使CT水平也較穩(wěn)定。4.4.對T的影響本實驗結(jié)果顯示強骨寶組和骨松寶組的T水平顯著高于模型組，與正常組相比無明顯變化。GC有三條途徑可影響T的生成：一是通過對睪丸的直接作用抑制T的生成（32,52,53）；二是通過抑制下丘腦雄性激素釋放激素的分泌，減少T的合成（54）;三是通過抑制HPA軸的功能，減少腎上腺皮質(zhì)分泌雄激素（31）。強骨寶2號能夠升高血清中T的水平，可能是通過拮抗GC的上述部分或全部的作用機制實現(xiàn)的。關(guān)于雄性激素對骨代謝的重要性以及具體作用機制，在發(fā)病機制中已討論過，實驗結(jié)果提示強骨寶2號可能通過抑制GC降低性激素作用，從而間接促進骨形成、減少骨吸收，減少骨量的丟失。5.對骨組織形態(tài)學的影響5.1光學顯微鏡觀察本研究在觀察HE染色的脫鈣骨切片時發(fā)現(xiàn)，強骨寶組和骨松寶組的骨小梁的數(shù)量明顯多于模型組，髓梁比例小于模型組，第13周骨小梁的厚度明顯大于模型組，發(fā)生斷裂的骨小梁的數(shù)量也小于模型組。同時強骨寶和骨松寶組穿孔的骨小梁多于正常組，骨小梁分布也較正常組稀疏。光鏡下的觀察結(jié)果大致反映強骨寶2號能夠減少GC所致的骨丟失、改善骨顯微結(jié)構(gòu)，同時也提示強骨寶2號還不能完全防止GC導致的骨丟失和對骨質(zhì)的破壞。骨組織形態(tài)計量學測量骨組織形態(tài)計量學是定量檢測骨量、骨形成和骨吸收的一種評估骨代謝的方法。強骨寶組與骨松寶組的骨量指標，即骨小梁面積（Tb.Ar）和骨小梁數(shù)量（Tb.No）都較模型組顯著升高，第13周，骨小梁的寬度明顯大于模型組，說明強骨寶2號與骨松寶能夠有效地預防GC所致的骨量丟失，改善并維持骨顯微結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果還顯示強骨寶2號與骨松寶能夠促進骨形成，這兩組的的礦化沉積率（MAR）、熒光標記周長（Lb.Pm）以及單位體積的骨形成率（BFR/TV）與模型組相比，顯著增高，但骨小梁面積（Tb.Ar）和骨形成率（BFR/TV）沒有達到正常組的水平，提示強骨寶2號能夠部分拮抗GC對骨形成的抑制。強骨寶組的代表骨吸收的參數(shù)破骨細胞吸收表面（OC.Sur）顯著低于模型組，表明強骨寶2號能夠拮抗GC誘導破骨細胞性骨吸收增強的作用。Eastell認為GC所致的骨質(zhì)疏松主要是抑制骨形成，促進骨吸收的作用是次要的（18）,其促進骨吸收的作用主要是由繼發(fā)性高PTH所致（56），因此強骨寶2號降低骨組織形態(tài)計量學中骨吸收指標的機制，很可能是通過降低血清中PTH的途徑實現(xiàn)的。本實驗的結(jié)果還顯示，骨松寶組雖然在骨量以及骨形成指數(shù)方面要高于模型組，但第13周，破骨細胞的吸收表面，要明顯高于正常對照組，與模型組相比無明顯差異，結(jié)果提示骨松寶在13周的時間內(nèi)，其抗骨吸收的作用尚不肯定。對骨超微結(jié)構(gòu)的影響新形成的骨細胞在正常情況下，表現(xiàn)為成骨細胞的特征，具有活躍的分泌能力，后期表現(xiàn)為相對靜止的骨細胞，主要表現(xiàn)為吸收相或退變相的骨細胞，但在不同環(huán)境因素的刺激下，骨細胞的演變周期可發(fā)生變化，即從成骨相到退變相的過程可延遲或縮短（36）。骨組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，強骨寶組的成骨相骨細胞要明顯地高于模型組，并且成骨相和吸收相骨細胞的比例大致相當，表明強骨寶2號糾正了GC造成的使骨細胞偏向于吸收相或退變相的內(nèi)環(huán)境；強骨寶組成骨細胞、成骨相骨細胞、骨陷窩中膠原的增多以及其升高BGP結(jié)果提示強骨寶2號可能消除GC加速骨細胞退變及誘導成骨細胞凋亡的作用（37），相對地增強了成骨細胞和骨細胞的骨形成能力。骨松寶組中的骨組織細胞的超微結(jié)構(gòu)，與強骨寶組大致相似。強骨寶2號主要由淫羊藿、黃芪、鹿角膠、骨碎補、澤瀉、丹參、蒼術(shù)、牡蠣等8味中藥組成，強骨寶2號組方的出發(fā)點是以補腎藥為主，再針對GC副作用造成的痰濕淤阻等證，佐以益氣、活血、利濕等藥組成，具有補腎填精，益氣活血，化痰利濕的功效。從總體上看補腎中藥具有提高血清中睪酮水平的作用（9），并且以補腎中藥為主的方藥可以提高GC性骨質(zhì)疏松模型的1，25-（OH）2D3的水平，增強腸道鈣結(jié)合蛋白的基因表達，增加腸道對鈣的吸收（7,56）。李芳芳等人發(fā)現(xiàn)，活血化淤中藥可提高去勢大鼠血鈣水平，能夠延緩去勢大鼠的骨丟失（57）。實驗研究證實方中的主藥淫羊藿主要成份有淫羊藿甙、淫羊藿黃酮、淫羊藿多糖等，對骨組織的代謝有多方面的作用，淫羊藿注射液能夠明顯減少體外培養(yǎng)的破骨細胞在骨片上形成的骨吸收窩數(shù)量，并呈量效關(guān)系，表明淫羊藿對破骨細胞有直接的抑制作用（58），淫羊藿多糖還能影響骨髓細胞核酸的代謝，提高體外培養(yǎng)的骨髓細胞的增殖率（59），單味淫羊藿還可保護外源性GC對HPA軸的抑制，淫羊藿水提液能提高去睪丸大鼠的睪酮的水平及骨量（60）。方中黃芪含有黃芪多糖、亞油酸、多種氨基酸及鈣磷元素，黃芪能夠改善微循環(huán)，促進核酸和蛋白質(zhì)的代謝，并且具有雌激素樣作用（61）。動物實驗證實以淫羊藿和黃芪兩味中藥組成的骨寶，以及從淫羊藿、黃芪和蒼術(shù)提取的壯骨腎寶液都能減少GC所致的骨丟失（62,63）。鹿角膠含有賴氨酸、色氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等大量的人體必需氨基酸以及雄激素、雌激素等，有利于體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及骨基質(zhì)的形成（64）。澤瀉含有各種揮發(fā)油、生物堿、甙、蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，有利尿、降血脂等藥理作用（65）。方中的丹參有改善微循環(huán)及血流變學的作用，臨床試驗證實丹參酮有雌激素樣作用，可以明顯地降低尿鈣和尿羥脯氨酸，抑制過度的骨吸收，并可促進體外培養(yǎng)的成骨樣細胞的有絲分裂，促進其成熟及成骨能力（66）。方中的牡蠣80%-95%的成分為碳酸鈣、磷酸鈣和硫酸鈣，并含有鎂、鋁、硅等微量元素，在復方中具有補充鈣的作用（67）.綜上所述，強骨寶2號組方藥物既可從細胞水平影響骨代謝，又可通過對內(nèi)分泌系統(tǒng)及微循環(huán)的影響拮抗GC的副作用。但由于中藥的成份較復雜，強骨寶2號又是由多味中藥組成的復方，其對機體影響是多方面的，從現(xiàn)有的研究結(jié)論還難以用簡單的幾種機制來闡述其藥理作用，有待于進一步研究闡明。雖然強骨寶2號也是以補腎藥為主，但與骨松寶相比，功效相對地更偏于利濕活血。通過實驗結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，二者在影響骨吸收方面存在一些差異。強骨寶組的反映動態(tài)骨吸收的指標破骨細胞吸收表面周長比骨松寶組有減少的趨勢，有顯著意義。除此之外，兩組中骨形成的生化指標BGP和AKP以及骨吸收的生化指標HOP無太大的差異，PTH和CT變化也大致相當，在光學顯微鏡下對皮質(zhì)骨和小梁骨的結(jié)構(gòu)觀察、靜態(tài)骨量以及動態(tài)骨形成指標也大致相同，骨組織超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果顯示，兩組標本都可觀察到成骨相和吸收相2個階段的骨細胞?？偫ㄉ肮墙M織形態(tài)觀察和定量測定，強骨寶2號與骨松寶在預防骨量丟失、促進骨形成以及維持正常的骨組織結(jié)構(gòu)方面具有相似的療效，在減少骨吸收方面強骨寶2號要略優(yōu)于骨松寶。骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)發(fā)生退變?yōu)樘卣鳎瑢嶒灲Y(jié)果表明強骨寶2號與骨松寶在預防骨量丟失以及改善骨微結(jié)構(gòu)方面療效相當，并且二者的骨量和骨形成指標均未達到正常對照組的水平，說明強骨寶2號和骨松寶雖然能夠有效地預防GC造成的骨量丟失、拮抗GC對骨結(jié)構(gòu)的破壞，但不能完全預防。同時也提示預防GC性骨質(zhì)疏松的困難性，單純用一種治療方式難以徹底預防其發(fā)生，在臨床中需聯(lián)合用藥。小結(jié)強骨寶2號能夠有效地減少GC所致骨質(zhì)疏松模型的骨量丟失，改善骨微結(jié)構(gòu)，可能有如下作用機制：1.糾正GC導致的鈣磷代謝紊亂，阻止繼發(fā)性高甲狀旁腺激素血癥，減少高PTH所致的過度骨吸收2.促進雄激素的合成和分泌，增加骨基質(zhì)合成促進骨形成，減少骨吸收3.拮抗GC對成骨細胞和骨細胞的抑制，增加成骨細胞的活性，促進骨形成參考文獻1．GlucoPS,MulloyALGlucocorticoidinducedosteoporosispathogenesis,preventionandtreatment.ClinExpRheumatol,1996;199-2062．osteoporosis-mechanismandmanagement.EurJEndocrinol,1997Sep137(3):209-2173．HachullaE,CortetB.Preventionofglucocorticoidinducedosteoporosis.RevMedInterne,1998;19:492-5004．郭長亮.激素引起腎虛與中藥治療.中醫(yī)藥研究，1990;35(5):425．付文錄.使用激素對中醫(yī)證的影響.中醫(yī)藥信息，1989;3:56．時光達，陳寶興，主編.實驗骨傷科學.第1版，北京：人民衛(wèi)生出版社，1993;4:1537．劉和娣，李恩，劉嵬.補腎中藥對骨質(zhì)疏松大鼠CaBP-D9k基因及表達的影響.中國骨質(zhì)疏松雜志，1996;2(3):62-648．朱憲彝，主編.臨床內(nèi)分泌學.第1版，天津：天津科學技術(shù)出版社，1993:3299．沈培芝，李東煜，張戈，等.補腎方防治地塞米松致雄性大鼠骨質(zhì)疏松及其生化機制探討.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998;18(5):29010．薛延，主編.骨質(zhì)疏松診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