細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（鱟試驗(yàn)）的全面解析一般細(xì)菌毒素可分為兩類(lèi)，一類(lèi)為外毒素(Exotoxin)；它是一種毒性蛋白質(zhì)，是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌到菌體外的毒性物質(zhì)。產(chǎn)生外毒素的細(xì)菌主要是革蘭氏陽(yáng)性菌。如白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數(shù)革蘭氏陰性菌。另一類(lèi)為內(nèi)毒素(Endotoxin)，是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的產(chǎn)物。細(xì)菌在生活狀態(tài)時(shí)不釋放出來(lái)，只有當(dāng)細(xì)菌死亡自溶或粘附在其它細(xì)胞時(shí)，才表現(xiàn)其毒性，內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分是脂多糖中的類(lèi)脂A成分。和熱原的關(guān)系熱原(pyrogen包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。細(xì)菌內(nèi)毒素被認(rèn)為是熱原的本質(zhì)，此事在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)議，熱原不僅是細(xì)菌內(nèi)毒素。但在藥檢的范疇，細(xì)菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說(shuō)無(wú)內(nèi)毒素就無(wú)熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。熱原反應(yīng)：含有熱原的注射劑注入人體可引起發(fā)熱反應(yīng)，使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時(shí)體溫可升至40℃，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時(shí)搶救，可危及生命。來(lái)源和控制方法1、細(xì)菌內(nèi)毒素的特性2、去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭對(duì)熱原的吸附作用達(dá)到去除作用的方法。常用的吸附劑中，活性炭對(duì)熱原的吸附作用最強(qiáng)，一般用量為總?cè)萘康?.1%-0.5%，將溶液加熱到70℃左右保溫一定時(shí)間效果更好。使用的活性炭應(yīng)符合藥典規(guī)定要求。(2)蒸餾法此法是利用熱原具有不揮發(fā)性而達(dá)到去除目的。因此，凡適于蒸餾的藥品均可用蒸餾法除去熱原。熱破壞法此法是利用熱高溫能破壞熱原質(zhì)達(dá)到去除目的。因此，凡適用于高溫處理的如熱原檢查試驗(yàn)中接觸藥液的容器，可用180℃干烤3小250℃30min強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理法此法利用強(qiáng)酸強(qiáng)堿能破壞熱原而達(dá)到去除的目的。(5)其他，也可以采用過(guò)濾等方法去除熱原。熱原及內(nèi)毒素檢驗(yàn)法、家兔熱原法由于家兔對(duì)熱原的反應(yīng)與人基本相似，家兔法為各國(guó)藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法?！吨袊?guó)藥典》2005年版規(guī)定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性取決于試驗(yàn)動(dòng)物的狀況、試驗(yàn)室條件和操作的規(guī)范性。家兔法檢測(cè)內(nèi)毒素的靈敏度為 試驗(yàn)結(jié)果接近人體真實(shí)情況，但操作繁瑣費(fèi)時(shí)，不能用于注射劑生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控，且不適用于放射性藥物、腫瘤抑制劑等細(xì)胞毒性藥物制劑。2、鱟試劑法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法．細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。細(xì)菌內(nèi)毒素這個(gè)概念在1890年的時(shí)候就已被提了出來(lái)，它是在研究發(fā)熱物質(zhì)過(guò)程所引起的，年Boivin最先由小鼠傷寒桿菌提取出來(lái)，進(jìn)行化學(xué)免疫學(xué)方面的研究，到1940年時(shí)候，Morgan使用志賀氏痢疾菌闡明了細(xì)菌內(nèi)毒素是由多糖脂質(zhì)及蛋白質(zhì)三部分所組成的復(fù)合體，到了1950學(xué)等的進(jìn)步發(fā)展，細(xì)菌內(nèi)毒素的研究工作，尤其是其化學(xué)結(jié)構(gòu)組成及各種生物活性間的關(guān)系也更加明確起來(lái)。1956年美國(guó)人Bang發(fā)現(xiàn)美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生凝膠。其后Levin和Bang又搞清楚微量革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素也可以引起凝膠反應(yīng)，從而創(chuàng)立了鱟試劑檢測(cè)法。由于鱟試劑法簡(jiǎn)單﹑快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確，已廣泛用于臨床、制藥工業(yè)藥品檢驗(yàn)等方面。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括凝膠法和光度測(cè)定法兩種方法，前者利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素。鱟試劑法檢查內(nèi)毒素的靈敏度為0.0001μg/ml,比家兔法靈敏10倍，操作簡(jiǎn)單易行，試驗(yàn)費(fèi)用低，結(jié)果迅速可靠，適用于注射劑生產(chǎn)過(guò)程中的熱原控制和家兔法不能檢測(cè)的某些細(xì)胞毒性藥物制劑，但其凝膠法、比濁法、顯色法的原理圖3、凝膠法簡(jiǎn)介最常用方法：細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法原理：常用英文縮寫(xiě)：BET：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查BETNC：陰性對(duì)照λ：鱟試劑靈敏度 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值儀器：1、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱作用：干烤去熱原方式：250℃干烤30min以上。注意事項(xiàng)：250℃開(kāi)始計(jì)時(shí)。干烤過(guò)程中不得開(kāi)啟干燥箱的門(mén)。干烤物品不要疊放不要裝載過(guò)滿(mǎn)，以免影響空氣流通。(42、漩渦混合器作用：混旋細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，保證標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度一致。方式：對(duì)凍干粉的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后，應(yīng)混旋15min。標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋過(guò)程中，每步稀釋?xiě)?yīng)混旋30s。漩渦混合后與漩渦混合前3、試管恒溫儀作用：提供37℃恒溫的環(huán)境。方式：對(duì)加入了內(nèi)容物的鱟試劑分別放置于試管恒溫儀中，37℃恒溫60min±2min溫育培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。試劑：細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：工作標(biāo)準(zhǔn)品、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品1細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測(cè)內(nèi)毒素的敏感試劑。2、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：含細(xì)菌內(nèi)毒素的量極低：<0.015EU/ml，不引入細(xì)菌內(nèi)毒素，對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用。內(nèi)毒素檢驗(yàn)的注意事項(xiàng)：溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時(shí)，不要?jiǎng)×艺袷幈苊猱a(chǎn)生氣泡。由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過(guò)程中及觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)注意不要使試管受到振動(dòng)，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。各個(gè)實(shí)驗(yàn)中要求的對(duì)照應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)有效的情況下才能進(jìn)行計(jì)算和判斷。內(nèi)毒素的臨床應(yīng)用：內(nèi)毒素血癥內(nèi)毒素血癥是由于血中細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌釋放出大量?jī)?nèi)毒素至血液，或輸入大量?jī)?nèi)毒素污染的液體而引起。內(nèi)毒素血癥分為內(nèi)源性和外源性?xún)纱箢?lèi)。1、內(nèi)毒素血癥發(fā)生的原因在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下可出現(xiàn)：素過(guò)多而超過(guò)機(jī)體清除能力；胃腸道粘膜缺血、壞死、屏障破壞，大量?jī)?nèi)毒素釋放入血；(4)某些組織、器官的感染引起外源性?xún)?nèi)毒素入血。2、內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以及休克等。內(nèi)毒素可引起組胺、5前列腺素、激肽等的釋放，導(dǎo)致微循環(huán)擴(kuò)張，靜脈回流血量減少，血壓下降，組織灌流不足，缺氧及酸中毒等。3、內(nèi)毒素血癥的后果內(nèi)毒素血癥可以出現(xiàn)在多系統(tǒng)的多種疾病中，通常導(dǎo)致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等，病死率極高。內(nèi)毒素血癥可引起一系列病理生理改變：①發(fā)熱反應(yīng)：內(nèi)毒素直接作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，或作用于白細(xì)胞使之釋放內(nèi)原性致熱原；②促使血管活性物質(zhì)如緩激肽、組胺、5-羥色胺、血管緊張素等釋放，使血壓下降，導(dǎo)致微循環(huán)障礙；③引起白細(xì)胞和血小板減少，激活凝血、纖溶系統(tǒng)，產(chǎn)生出血傾向；彌漫性血管內(nèi)凝血；④經(jīng)C3旁路或經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體；⑤直接或間接損害肝臟，引起糖代謝紊亂及酶學(xué)、蛋白代謝的改變；⑥激活白三烯、前列腺素、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞活性。4、各類(lèi)疾病內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率急性肝炎37-64%；爆發(fā)性肝炎58-100%；丙肝61.54%；膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%；燒傷85%；敗血癥70%；多器官功能衰竭100%；急性胰腺炎90%；皮膚軟組織感染70-81.1%；腹腔感染72-84%；尿路感染70-80%(腎炎)、癌癥70%；肺炎100%；上感100%。5、內(nèi)毒素血癥的治療治療原則多主張：①減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收；②改善內(nèi)毒素引起的微循環(huán)障礙。6、內(nèi)毒素血癥-發(fā)燒病人敗血癥的早期預(yù)測(cè)革蘭氏陰性菌敗血癥是住院病人