聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第1頁/共63頁基因克?。ǜ惺軕B(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定）Westernblot（蛋白質(zhì)提取、SDS、轉(zhuǎn)膜、免疫檢測）RT-PCR（RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR）實驗內(nèi)容實驗考試第2頁/共63頁分子生物學(xué)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（polymerasechainreaction,

PCR）第3頁/共63頁KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodTheNobelPrizeinChemistry1993第4頁/共63頁第5頁/共63頁P(yáng)CRPCR的產(chǎn)物數(shù)目以指數(shù)級方式增長DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理論上可達(dá)2n個拷貝原料（pg）產(chǎn)物(ug)

體外高效、快速、特異地擴(kuò)增目的基因或DNA片段第6頁/共63頁P(yáng)CR基本原理

PCR反應(yīng)體系

PCR結(jié)果分析

PCR方法拓展

PCR的應(yīng)用第7頁/共63頁P(yáng)CR的基本原理

其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，在試管中的DNA的體外合成。第8頁/共63頁5’3’5’3’DirectionofunwindingContinuousreplicationPrimer5’3’Primer5’3’Discontinuousreplication5’3’Primer岡崎片段(okazakifragment)replicationfork第9頁/共63頁DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：templateDNA（genomicDNA

），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，

DNA聚合酶，連接酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37℃

反應(yīng)過程：起始（模板DNA解鏈、形成引發(fā)體）、延長、終止（三階段）產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA，cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer，dNTPsDNApolymerasebuffer，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三階段，多循環(huán)）目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍第10頁/共63頁Denaturation（變性）templateDNA(dsDNA)——95℃±——denaturation——ssDNA第11頁/共63頁Annealing（退火）Primer（引物）：兩條寡核苷酸鏈；分別與待擴(kuò)增的目標(biāo)片段兩端的序列互補(bǔ)。

primers第12頁/共63頁Extension（延伸）Taq酶dNTPS

新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。

DNA聚合酶：催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按堿基配對的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的復(fù)制鏈。第13頁/共63頁變性-退火-延伸——一個PCR循環(huán)第14頁/共63頁盡管PCR擴(kuò)增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴(kuò)增并不是一個無限制的過程。在正常的反應(yīng)條件下，30次循環(huán)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和平臺效應(yīng)

(Plateau)“平臺效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。第15頁/共63頁理論上，n個循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。實際上，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為（1+X）n，

X為擴(kuò)增效率，平均為75%第16頁/共63頁第17頁/共63頁template血液陳舊血痕組織塊或石蠟包埋組織絨毛毛發(fā)羊水脫落細(xì)胞尿咽拭子DNARNA

mRNAcDNA第18頁/共63頁primer引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2.保證引物中G-C比例為50%±15%，ATGC最好隨機(jī)分布。避免兩條引物間或引物內(nèi)部互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)。4.length<20bpTa（退火溫度）=(4×G/C+2×A/T–5°C);

length>20bp

Ta=62.3°C+0.41°C*(%GC)-5°C

保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75°C

范圍內(nèi)。

5.檢測目的DNA序列看是否有錯配區(qū)域，計算機(jī)程序分析可以幫助避免使用設(shè)計不合理的引物對。第19頁/共63頁引物的3端:必須嚴(yán)格互補(bǔ)引物的5端:可以不嚴(yán)格互補(bǔ),可以加酶切位點，加標(biāo)記物,引入突變位點等第20頁/共63頁5’-ggttacttccctcgatttgggcggggattcccttccatttttttcttcccttttctcccaagatccagcttcttgggggcactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcggcccc/ggagctgcatggccaactcccaccaggggccgctcctcccctaccccccacccccgggctccctctttaagtctctagctcaaggtacccgcctctccaaagggctcgtccc-3’(229bp)

ggttacttccctcgatttgggaggtttcccgagcaggg-5’第21頁/共63頁DNA

polymerase催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

第22頁/共63頁(dNTPs)

dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的總稱，是靶DNA序列擴(kuò)增的原料。dNTP濃度根據(jù)靶序列的長度和組成而定，一般使用濃度在50-200umol/L之間第23頁/共63頁buffer/Mg2+

常用的緩沖液體系為10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃）TaqDNA聚合酶需要游離Mg2+。第24頁/共63頁第25頁/共63頁AnalysisofPCRproductsGelanalysis(瓊脂糖凝膠電泳/聚丙烯酰胺凝膠電泳):PCR產(chǎn)物電泳，EB（溴乙錠）染色，紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。第26頁/共63頁第27頁/共63頁Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、電泳分離。產(chǎn)物的鑒定，基因分型，研究變異性。第28頁/共63頁Hybridization：

(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridization第29頁/共63頁Sequenceanalysis：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。第30頁/共63頁DNA測序

1.Sanger法（雙脫氧末端終止法）

用4種2′,3′―雙脫氧核苷酸（ddNTP）代替部分脫氧核苷酸（dNTP）作為底物進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，從而獲得在不同部位終止反應(yīng)的大小不同的DNA鏈，經(jīng)高分辨率變性聚丙烯凝膠電泳分離，就可以對DNA序列進(jìn)行分析第31頁/共63頁第32頁/共63頁Sanger法測定DNA序列第33頁/共63頁第34頁/共63頁2.DNA自動化測序方法要點●基于Sanger法的基本原理●用標(biāo)記熒光染料的ddNTP●經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離●用熒光檢測儀檢測信號經(jīng)計算機(jī)分析●得到DNA分子序列第35頁/共63頁DNA自動測序結(jié)果舉例第36頁/共63頁P(yáng)CRMETHODSSTANDARDPCRHOTSTARTPCRRTPCRINSITUPCRPCR-ELISAREALTIMEQUANTITATIVEPCR第37頁/共63頁

HOTSTARTPCRIn'hot-start'PCR，atleastonereactioncomponent,whichcanincludethepolymerase,salt(KClorMgCl2)ordNTP(s),iswithheldfromthereactionuntilthesystemreachesaparticulartemperature.第38頁/共63頁RT-PCR

(Reversetranscription-PCR)1.RNApreparation2.Reversetranscription3.PCR4.ResultAnalysis:QuantificationorcDNAclone第39頁/共63頁第40頁/共63頁Semi-QuantifyRT-PCR1.RNApreparetion2.Reversetranscription3.PCR:a.TargetGeneSpecifiedprimerb.GAPDHorβ-actinprimer4.Quantification第41頁/共63頁TargetGeneGAPDHorβ-actin在相對定量檢測中,為了比較不同樣本mRNA表達(dá)量水平,要求不同的樣本之間起始細(xì)胞數(shù)目相同,RNA提取效率相同,且目的基因的擴(kuò)增效率相同,不可能同時滿足。為了避免不同標(biāo)本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別,獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異選擇一定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化甘油醛-3-磷酸脫氫酶根據(jù)實驗，選擇內(nèi)參基因第42頁/共63頁第43頁/共63頁實時PCR的基本過程第44頁/共63頁基因克隆醫(yī)學(xué)檢測(基因診斷)WHATCANPCRDOFORUS?第45頁/共63頁一、基因克隆:PCR應(yīng)用PCRProductdigestmixDNAligaseplasmid

Genecloning:

PCRproduct+vector

第46頁/共63頁第47頁/共63頁P(yáng)CR法設(shè)計引物分段PCR基因改造第48頁/共63頁再次PCR獲得突變基因第49頁/共63頁(一).基因突變的檢測

1、基因缺失或插入

基因檢測第50頁/共63頁2、點突變位于酶切位點上的點突變：限制性酶切片段分析法不在酶切位點上的點突變：單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)

致病基因上的未知點突變：PCR-SSCP（單核苷酸多態(tài)性，SNP）第51頁/共63頁P(yáng)CR-RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

限制性片段長度多態(tài)性1.分析已知突變。2.突變堿基涉及酶切位點的變化。PCR酶切

電泳第52頁/共63頁P(yáng)CR-RFLP5’CCACGG3’3’GGTGCC5’*5’CCATGG3’3’

GGTACC5’*ResistancetoNcoIDigestionSusceptibletoNcoIDigestion第53頁/共63頁HomozygousMutantHomozygousWild-typeHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP第54頁/共63頁第55頁/共63頁SSCPPCRPCRATCGWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutant第56頁/共63頁DenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAmoleculesconformationdependsontheirsequenceRunonaNon-denaturinggelandlookformobilitydifferen