細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第1頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第2頁(yè)病毒污染和檢測(cè)細(xì)胞直接觀察動(dòng)物接種檢驗(yàn)電子顯微鏡觀察免疫學(xué)檢驗(yàn)PCR技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第3頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第4頁(yè)1、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是試驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫l(fā)污染。最常見(jiàn)有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。

培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最終變圓脫落死亡。

細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第5頁(yè)小鼠胃癌細(xì)胞球菌感染白色念珠菌污染：（細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第6頁(yè)2、真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最終因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第7頁(yè)3、支原體污染檢測(cè)（1）相差顯微鏡觀察

直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見(jiàn)類似于布朗運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。

細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第8頁(yè)（2）熒光染色法觀察

用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。

細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第9頁(yè)（3）電鏡檢測(cè)

若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。普通在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞靠近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第10頁(yè)（4）培養(yǎng)檢測(cè)

將細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有沒(méi)有霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有沒(méi)有“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。

細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第11頁(yè)肺炎支原體掃描電鏡照片雞敗血支原體油煎蛋樣菌落細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第12頁(yè)P(yáng)CR法測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染引物來(lái)自支原體保守16S-23SrRNA序列，因?yàn)檫@段spacer序列隨支原體種類不一樣而不一樣，所以可依所復(fù)制DNA大小及其特異性片段大小來(lái)作檢測(cè)及判定。細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第13頁(yè)一、細(xì)菌和真菌去除

§1、使用抗生素

§抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)適用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。

§預(yù)防用藥普通用雙抗生素，污染后去除用藥需采取大于慣用量5～10倍沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第14頁(yè)

二、支原體去除

§１、用MRA處理

用支原體

去除劑（Mycoplasma

Removal

Agent）處理細(xì)胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康．

2、用清洗純化法去除支原體污染方法

細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群篩選→細(xì)胞清洗→重復(fù)離心洗滌

其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液浮力差到達(dá)去除支原體目標(biāo)。因?yàn)橹гw個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以經(jīng)過(guò)重復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在支原體數(shù)量降低至極限.

如結(jié)合敏感抗生素抑殺作用，可到達(dá)更加好效果。

3、藥品輔助加溫處理

先用藥品處理后，再將污染組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。

４、使用支原體特異性血清

§用5%兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，而且5個(gè)月后仍為陰性。

細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第15頁(yè)

三、污染預(yù)防

§預(yù)防是預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染最好方法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染可能性降到最小程度。

§普通預(yù)防：

1、添加抗生素

2、從物品、用具消毒滅菌著手

§細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無(wú)菌試驗(yàn)陰性后才能使用。

§操作室及剩下無(wú)菌器材要定時(shí)清潔消毒滅菌。

細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第16頁(yè)

3、從操作者做起

（1）進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手，按要求穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

（2）操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無(wú)菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。（3）操作時(shí)要常更換吸管細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)及預(yù)防第17頁(yè)

4、預(yù)防細(xì)胞交叉污染

§在進(jìn)行各種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。

§