第四章蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和穩(wěn)定化生命科學(xué)學(xué)院:柯德森Desenke@21QQ270820679蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第1頁研究意義:了解蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)關(guān)系是了解蛋白質(zhì)分子自我裝配過程關(guān)鍵.研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性機(jī)制是實(shí)現(xiàn)酶工程研究目標(biāo)主要基礎(chǔ).蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第2頁第一節(jié):蛋白質(zhì)穩(wěn)定性一.蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分子原因蛋白質(zhì)穩(wěn)定性:蛋白質(zhì)抵抗各種原因影響,保持其生物活力能力.蛋白質(zhì)特定功效是由其特定空間結(jié)構(gòu)決定,要保持其生物活力,必須保持其空間結(jié)構(gòu),穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)原因是什么?了解蛋白質(zhì)穩(wěn)定性概念?蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第3頁維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定主要原因:金屬離子、底物、輔因子和其它相對(duì)低分子質(zhì)量配體結(jié)合作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂作用鹽橋和氫鍵二硫鍵對(duì)氧化修飾敏感氨基酸含量較低氨基酸殘基堅(jiān)實(shí)裝配疏水相互作用(思索題)疏水性標(biāo)尺疏水性氨基酸越多越穩(wěn)定?蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第4頁疏水性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性關(guān)系小結(jié)疏水性大小與穩(wěn)定性沒有必定聯(lián)絡(luò)非極性氨基酸在蛋白質(zhì)球體內(nèi)規(guī)則排列是穩(wěn)定性原因之一增加疏水作用是穩(wěn)定蛋白質(zhì)實(shí)用方法:降低蛋白質(zhì)表面疏水性,增加蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第5頁二.測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方法比較蛋白質(zhì)穩(wěn)定性準(zhǔn)則包含:熔化溫度Tm;蛋白質(zhì)伸展二分之一時(shí)變性劑濃度蛋白質(zhì)自由能;最大穩(wěn)定性溫度(Ts);在特定溫度下蛋白質(zhì)功效活性維持時(shí)間.思索蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第6頁熔化溫度Tm和蛋白質(zhì)伸展50%時(shí)變性劑濃度是預(yù)測酶穩(wěn)定性最有用參數(shù);Tm:

蛋白質(zhì)受熱伸展過渡中點(diǎn)時(shí)溫度;變性劑濃度:蛋白質(zhì)加變性劑伸展過程中使蛋白質(zhì)伸展二分之一時(shí)所需要變性劑濃度;蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第7頁蛋白質(zhì)失活原因和機(jī)理蛋白質(zhì)水解酶和自溶作用聚合作用:蛋白質(zhì)首先發(fā)生可逆性伸展,伸展蛋白質(zhì)分子彼此締合,以最大程度降低疏水氨基酸暴露于水溶劑,最終可能發(fā)生蛋白質(zhì)分子間二硫鍵形成,從而使蛋白質(zhì)沉淀析出.蛋白質(zhì)聚合作用可能是不可逆,并不一定是不可逆.思索聚合假如發(fā)生共價(jià)鍵就是不可逆?蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第8頁極端pH:活性中心氨基酸必需基團(tuán)電離.pH改變能夠引發(fā)蛋白質(zhì)伸展,這個(gè)過程標(biāo)準(zhǔn)上是可逆,但這些改變常能造成不可逆聚合或酶自溶,引發(fā)不可逆失活.氧化作用:各種氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。分子氧、H2O2和氧自由基是常見蛋白質(zhì)氧化劑。表面活性劑和去污劑表面活性劑在很低濃度下能使蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈相互作用,造成蛋白質(zhì)不可逆變性.其中陰離子去污劑作用比陽離子和非離子去污劑強(qiáng)烈.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第9頁變性劑：脲和鹽酸胍:機(jī)制尚不明確,可能是消除了維持三級(jí)結(jié)構(gòu)疏水作用力或直接與蛋白質(zhì)分子作用.高濃度鹽：高濃度鹽現(xiàn)有穩(wěn)定作用也有變性作用，這要看鹽性質(zhì)和濃度。螯合：經(jīng)常不可逆地失活需要金屬輔因子酶，但可穩(wěn)定不需要金屬輔因子酶；有機(jī)溶劑：改變?nèi)芤航殡姵?shù);增加疏水核溶解度,降低帶電表面溶解度;奪去酶分子表面必需水而使酶失活.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第10頁重金屬離子和巰基試劑:與蛋白質(zhì)巰基、二硫鍵以及色氨酸、組氨酸殘基反應(yīng)。熱:熱失活是工業(yè)上最經(jīng)常碰到酶失活原因.熱失活也分二步過程:伸展---不可逆失活.機(jī)械力：振動(dòng)、剪切、超聲波、壓力都可能引發(fā)蛋白質(zhì)變性，這種變性理論上是可逆，但也可能伴伴隨其它反應(yīng)而不可逆地失活。冷凍和脫水：冷凍和脫水時(shí)，溶質(zhì)被濃縮，引發(fā)酶微環(huán)境中pH和離子強(qiáng)度猛烈改變，減弱疏水相互作用,并可能引發(fā)二硫交換和巰基氧化。輻射作用:輻射可產(chǎn)生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或間接地作用于蛋白質(zhì)分子.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第11頁第三節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定化一是怎樣預(yù)防蛋白質(zhì)可逆伸展，能夠開發(fā)出普遍適用方法；二是一旦酶發(fā)生了可逆伸展，怎樣預(yù)防其不可逆失活反應(yīng)發(fā)生，對(duì)此針對(duì)不一樣失活原因采取不一樣特殊穩(wěn)定化方法。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第12頁一.固定化：固定化穩(wěn)定酶原因：空間障礙、機(jī)械方式空間限制?？臻g障礙：因?yàn)榭臻g障礙能夠預(yù)防蛋白水解酶作用，阻擋酶與化學(xué)失活劑接觸，同時(shí)妨礙氧向酶擴(kuò)散能夠保護(hù)對(duì)氧不穩(wěn)定酶。機(jī)械方式:使酶發(fā)生交聯(lián)或包埋在載體緊密孔中能夠使酶構(gòu)象愈加堅(jiān)牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過渡?？臻g限制引發(fā)表觀穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第13頁非共價(jià)修飾反相膠束添加劑:專一性底物及配體;非專一性中性鹽和多羥基物質(zhì);與失活劑競爭物質(zhì);除掉破壞化學(xué)催化劑物質(zhì)蛋白質(zhì)間非共價(jià)相連蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第14頁化學(xué)修飾：修飾作用可到達(dá)穩(wěn)定酶作用，得到可溶性穩(wěn)定化酶?？扇苄源蠓肿有揎椕福壕垡叶迹≒EG）、右旋糖苷、肝素等。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第15頁小分子修飾酶原因：修飾有時(shí)會(huì)取得不一樣于天然蛋白質(zhì)構(gòu)象更穩(wěn)定構(gòu)象；修飾關(guān)鍵功效基團(tuán)也會(huì)到達(dá)穩(wěn)定化；由化學(xué)修飾引入到蛋白質(zhì)新功效基有可能形成附加氫鍵或鹽鍵；用非極性試劑修飾可加強(qiáng)蛋白質(zhì)中疏水相互作用；蛋白質(zhì)表面基團(tuán)親水性；交聯(lián)酶晶體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化專家講座第16頁蛋白質(zhì)工程：用基因操縱技術(shù)高度專一性地改變目標(biāo)蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：提供了有目標(biāo)改變酶性