核酸生物合成NucleicAcidBiosynthesis第十二章制作人：周賽男生物化學教研室核酸的合成專業(yè)知識培訓第1頁遺傳中心法則1958年Crick提出以DNA為中心遺傳信息傳遞規(guī)律，即DNA貯存遺傳信息經(jīng)過復制傳給子代DNA，經(jīng)過轉錄傳給RNA，再經(jīng)過翻譯傳給蛋白質。遺傳信息傳遞方向這個規(guī)律而稱之。DNARNA蛋白質復制復制轉錄翻譯反轉錄1970年Temin和Baltimore發(fā)覺RNA病毒RNA可經(jīng)過反轉錄（逆轉錄）將遺傳信息傳給cDNA。也可經(jīng)過RNA復制或RNA轉錄傳給子代RNA，這是對中心法則補充。1997年瘋牛病和朊病毒出現(xiàn)，預示蛋白質也可逆向將遺傳信息向DNA傳遞。？核酸的合成專業(yè)知識培訓第2頁中心法則最初內容：

?復制：以親代DNA為模板合成子代DNA分子；

?轉錄：以DNA為模板編碼RNA；

?翻譯：把編碼在mRNA上遺傳信息翻譯成有特殊氨基酸次序蛋白質。核酸的合成專業(yè)知識培訓第3頁中心法則補充內容：RNA病毒RNA可經(jīng)過反轉錄將遺傳信息給cDNA（反轉錄）；也能夠RNA復制或轉錄傳給自代RNA。核酸的合成專業(yè)知識培訓第4頁第一節(jié)DNA生物合成DNABiosynthesis核酸的合成專業(yè)知識培訓第5頁一、復制(replication)是指遺傳物質傳代，以親代（母鏈）DNA為模板合成子鏈DNA過程。復制親代DNA子代DNA核酸的合成專業(yè)知識培訓第6頁（一）DNA復制基本標準（二）參加DNA復制主要酶類（三）DNA復制過程核酸的合成專業(yè)知識培訓第7頁（一）DNA復制基本標準

1、半保留復制(semiconservativereplication)概念：試驗依據(jù)：密度梯度試驗生物學意義：（1）確保遺傳信息傳遞忠實性（2）遺傳和變異統(tǒng)一核酸的合成專業(yè)知識培訓第8頁密度梯度試驗

——試驗結果支持半保留復制構想。含重氮-DNA細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代梯度離心結果核酸的合成專業(yè)知識培訓第9頁2、半不連續(xù)復制(semi-discontinuousreplication)順著解鏈方向生成子鏈，復制是連續(xù)進行，這股鏈稱為領頭鏈。另一股鏈因為復制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制鏈稱為隨從鏈。復制中不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制半不連續(xù)性。核酸的合成專業(yè)知識培訓第10頁3535解鏈方向3′5′3′3′5′領頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)核酸的合成專業(yè)知識培訓第11頁（二）參加DNA復制主要酶類核酸的合成專業(yè)知識培訓第12頁參加DNA復制物質底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNADNA聚合酶，簡寫為DDDP或DNA-pol模板(template):解開成單鏈DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP能夠依次聚合

其它酶和蛋白質因子核酸的合成專業(yè)知識培訓第13頁108局部解鏈后（一）DNA拓撲異構酶(DNAtopoisomerase)

核酸的合成專業(yè)知識培訓第14頁解鏈過程中正超螺旋形成目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第15頁拓撲異構酶作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓撲異構酶Ⅰ

拓撲異構酶Ⅱ分類核酸的合成專業(yè)知識培訓第16頁拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當初候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端經(jīng)過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制

核酸的合成專業(yè)知識培訓第17頁目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第18頁（二）解螺旋酶（unwindingenzyme），又稱解鏈酶或rep蛋白。用于解開DNA雙鏈酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子ATP。核酸的合成專業(yè)知識培訓第19頁（三）單鏈DNA結合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結合蛋白質因子。其作用為：①使解開雙螺旋后DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復制子代DNA；②保護單鏈DNA，防止核酸酶降解。

核酸的合成專業(yè)知識培訓第20頁

（四）引物酶(primase)：是一個RNA聚合酶，在復制起始點處以DNA為模板，催化合成一小段互補RNA。引物酶能直接在單鏈DNA模板上催化游離NTP合成一小段RNA，并由這一小段RNA引物提供3’-OH，經(jīng)DNA聚合酶催化鏈延伸。

核酸的合成專業(yè)知識培訓第21頁解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白核酸的合成專業(yè)知識培訓第22頁復制化學反應

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第23頁

五、DNA聚合酶全稱：依賴DNADNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol活性：

53聚合酶活性：聚合作用53核酸外切酶活性：校讀、缺口充填35核酸外切酶活性：校讀功效核酸的合成專業(yè)知識培訓第24頁5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性

53外切酶活性?能切除引物（切口平移）校正能識別錯配堿基對，并將其水解。核酸的合成專業(yè)知識培訓第25頁核酸的合成專業(yè)知識培訓第26頁切口平移核酸的合成專業(yè)知識培訓第27頁5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目錄53聚合酶活性核酸的合成專業(yè)知識培訓第28頁

原核生物DNA聚合酶催化DNA聚合參加DNA損傷應急狀態(tài)修復切除引物、填補缺口、損傷修復功效2040400分子數(shù)/細胞1011亞基數(shù)--+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolI核酸的合成專業(yè)知識培訓第29頁功效：切除引物、填補缺口、損傷修復。DNA-polⅠ（109kD）核酸的合成專業(yè)知識培訓第30頁DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活它參加DNA損傷應急狀態(tài)修復。

核酸的合成專業(yè)知識培訓第31頁功效是原核生物復制延長中真正起催化作用酶。

DNA-polⅢ(250kD)核酸的合成專業(yè)知識培訓第32頁

真核生物DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性DNA-pol參加低保真度復制DNA-pol在線粒體DNA復制中起催化作用DNA-pol延長子鏈主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol校讀、修復和填補缺口核酸的合成專業(yè)知識培訓第33頁

六、DNA連接酶（ligase）；連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰DNA鏈連接成一條完整鏈。核酸的合成專業(yè)知識培訓第34頁HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’核酸的合成專業(yè)知識培訓第35頁（三）DNA復制過程核酸的合成專業(yè)知識培訓第36頁參加DNA復制物質底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNADNA聚合酶，簡寫為DDDP或DNA-pol模板(template):解開成單鏈DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP能夠依次聚合

其它酶和蛋白質因子核酸的合成專業(yè)知識培訓第37頁原核生物DNA生物合成

1、起始2、DNA鏈延長：

3、終止核酸的合成專業(yè)知識培訓第38頁（一）復制起始需要處理兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物DNA生物合成

核酸的合成專業(yè)知識培訓第39頁E.coli復制起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復序列反向重復序列53531.DNA解鏈核酸的合成專業(yè)知識培訓第40頁DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB35352.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域復合結構稱為引發(fā)體。

核酸的合成專業(yè)知識培訓第41頁3535引物是由引物酶催化合成短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶核酸的合成專業(yè)知識培訓第42頁(二）延長階段復制延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延長中子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵不停生成。

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

核酸的合成專業(yè)知識培訓第43頁

核酸的合成專業(yè)知識培訓第44頁領頭鏈合成核酸的合成專業(yè)知識培訓第45頁隨從鏈合成核酸的合成專業(yè)知識培訓第46頁目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第47頁復制過程簡圖核酸的合成專業(yè)知識培訓第48頁

（三）終止階段原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制復制片段在復制終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500核酸的合成專業(yè)知識培訓第49頁555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶隨從鏈上不連續(xù)性片段連接核酸的合成專業(yè)知識培訓第50頁哺乳動物細胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物DNA生物合成

?細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1→S及G2→M調整，與蛋白激酶活性相關。?蛋白激酶經(jīng)過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。核酸的合成專業(yè)知識培訓第51頁（一）DNA復制只發(fā)生在S期（二）多復制子（三）真核細胞含有5種DNA聚合酶（四）端粒復制染色體兩端DNA子鏈上最終復制RNA引物，去除后留下空隙。核酸的合成專業(yè)知識培訓第52頁端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端結構。功效?維持染色體穩(wěn)定性?維持DNA復制完整性結構特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質組成。?末端DNA序列是屢次重復富含G、T堿基短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…核酸的合成專業(yè)知識培訓第53頁端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成核酸的合成專業(yè)知識培訓第54頁端粒酶催化延長作用爬行模型目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第55頁DNA聚合酶復制子鏈深入加工目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第56頁53355335+5333355核酸的合成專業(yè)知識培訓第57頁二、逆轉錄(reversetranscription)

核酸的合成專業(yè)知識培訓第58頁（一）概念逆轉錄指遺傳信息從RNA流向DNA，是RNA指導下DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補DNA單鏈。RNADNA

逆轉錄酶核酸的合成專業(yè)知識培訓第59頁（二）逆轉錄酶(reversetranscriptase)

催化逆轉錄過程酶稱逆轉錄酶，RNA病毒中都含有此酶。含有三種酶活性：RNA指導DNA聚合酶RNA酶DNA指導DNA聚合酶核酸的合成專業(yè)知識培訓第60頁（三）合成過程

RNA模板逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA核酸的合成專業(yè)知識培訓第61頁逆轉錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目標基因主要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉錄合成與mRNA堿基序列互補DNA鏈。試管內合成cDNAcDNAcomplementaryDNA核酸的合成專業(yè)知識培訓第62頁逆轉錄研究意義

逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中重大發(fā)覺。

逆轉錄現(xiàn)象說明：最少在一些生物，RNA一樣兼有遺傳信息傳代與表示功效。對逆轉錄病毒研究，拓寬了20世紀初已注意到病毒致癌理論。

核酸的合成專業(yè)知識培訓第63頁三、DNA損傷與修復核酸的合成專業(yè)知識培訓第64頁(一）突變意義（一）突變是進化、分化分子基礎（二）突變可隨機發(fā)生（三）突變造成DNA多態(tài)性（四）突變是一些疾病發(fā)病基礎

核酸的合成專業(yè)知識培訓第65頁（二）引發(fā)突變原因1、物理原因：紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV核酸的合成專業(yè)知識培訓第66頁

2、化學原因：核酸的合成專業(yè)知識培訓第67頁（三）突變分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

核酸的合成專業(yè)知識培訓第68頁1、點突變（pointmutation)又稱錯配(mismatch)DNA分子上堿基錯配稱點突變(pointmutation)。（1）轉換：發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。（2）顛換：發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。核酸的合成專業(yè)知識培訓第69頁鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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C肽鏈CTCGAG基因核酸的合成專業(yè)知識培訓第70頁2、缺失(deletion)、插入(insertion)（1）缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。（2）插入：原來沒有一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。（3）缺失或插入都可造成框移(frame-shift)突變。框移突變是指三聯(lián)體密碼閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列次序發(fā)生改變。

核酸的合成專業(yè)知識培訓第71頁谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引發(fā)框移突變核酸的合成專業(yè)知識培訓第72頁由基因重排引發(fā)兩種地中海貧血基因型目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第73頁（三）DNA損傷修復1、光修復(lightrepairing)光修復酶(photolyase)

UV核酸的合成專業(yè)知識培訓第74頁

2、切除修復(excisionrepairing)是細胞內最主要和有效修復機制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。核酸的合成專業(yè)知識培訓第75頁UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接酶ATPE.coli切除修復機制核酸的合成專業(yè)知識培訓第76頁3、重組修復核酸的合成專業(yè)知識培訓第77頁4、SOS修復當DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復制時，由此而誘發(fā)出一系列復雜反應。在E.coli，各種與修復相關基因，組成一個稱為調整子(regulon)網(wǎng)絡式調控系統(tǒng)。這種修復特異性低，對堿基識別、選擇能力差。經(jīng)過SOS修復，復制如能繼續(xù)，細胞是可存活。然而DNA保留錯誤較多，造成較廣泛、長久突變。核酸的合成專業(yè)知識培訓第78頁第二節(jié)RNA生物合成RNABiosynthesis核酸的合成專業(yè)知識培訓第79頁在RNA聚合酶催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶遺傳信息傳遞給RNA過程稱為轉錄。經(jīng)轉錄生成RNA產物主要有rRNA、tRNA、mRNA。核酸的合成專業(yè)知識培訓第80頁復制和轉錄區(qū)分核酸的合成專業(yè)知識培訓第81頁一、參加轉錄主要物質模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)底物:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)其它蛋白質因子核酸的合成專業(yè)知識培訓第82頁5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結構基因轉錄方向轉錄方向1、選擇性轉錄(asymmetrictranscription)DNA分子上轉錄出RNA區(qū)段，稱為結構基因(structuralgene)。

（一）轉錄模板核酸的合成專業(yè)知識培訓第83頁DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指導轉錄生成RNA一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相正確另一股單鏈是編碼鏈(codingstrand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。

2、不對稱性轉錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第84頁5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質轉錄翻譯核酸的合成專業(yè)知識培訓第85頁

不對稱轉錄含義一是DNA鏈上只有部分區(qū)段作為轉錄模板(有意義鏈或模板鏈),二是模板鏈并非自始至終位于同一股DNA單鏈上。

核酸的合成專業(yè)知識培訓第86頁（二）RNA聚合酶1、原核生物RNA聚合酶

核酸的合成專業(yè)知識培訓第87頁關鍵酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)核酸的合成專業(yè)知識培訓第88頁RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)結合核酸的合成專業(yè)知識培訓第89頁2、真核生物RNA聚合酶

核酸的合成專業(yè)知識培訓第90頁

轉錄單位

原核生物轉錄單位稱為操縱子，通常由一個轉錄起始點、2個以上編碼序列與開啟序列、操縱序列以及其它調整序列在基因組中成簇串聯(lián)組成。開啟序列是RNA聚合酶結合并起動轉錄特異DNA序列。（三）模板與酶識別、結合核酸的合成專業(yè)知識培訓第91頁IPOZYA控制位點DNA阻遏蛋白開啟序列操縱序列β半乳糖苷酶通透酶乙?；D移酶乳糖操縱子（lactoseopron）結構RNA聚合酶結合位點調控基因結構基因調控序列核酸的合成專業(yè)知識培訓第92頁5335結構基因調控序列RNA-polRNA聚合酶結合模板DNA部位，稱為開啟子(promoter)。核酸的合成專業(yè)知識培訓第93頁RNA聚合酶保護法目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第94頁開始轉錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物開啟子保守序列RNA-pol識別位點(recognitionsite)55RNA聚合酶保護區(qū)結構基因33核酸的合成專業(yè)知識培訓第95頁TATA盒CAAT盒GC盒

增強子

順式作用元件結構基因-GCGC---CAAT---TATA轉錄起始真核生物開啟子保守序列緘默子

核酸的合成專業(yè)知識培訓第96頁二、轉錄過程核酸的合成專業(yè)知識培訓第97頁原核生物轉錄過程（一）起始階段1.RNA聚合酶全酶(2)與模板結合2.DNA雙鏈解開3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應，形成轉錄起始復合物5-pppG-OH+

NTP5-pppGpN

-OH3+ppiRNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3核酸的合成專業(yè)知識培訓第98頁（二）延長階段1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶關鍵酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移；2.在關鍵酶作用下，NTP不停聚合，RNA鏈不停延長。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi核酸的合成專業(yè)知識培訓第99頁轉錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（關鍵酶）

····DNA····RNA目錄核酸的合成專業(yè)知識培訓第100頁53DNA原核生物轉錄過程中羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶核酸的合成專業(yè)知識培訓第101頁

（二）終止階段指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉錄產物RNA鏈從轉錄復合物上脫落下來。分類：1.非依賴Rho因子轉錄終止2.依賴Rho()因子轉錄終止核酸的合成專業(yè)知識培訓第102頁1.非依賴Rho因子轉錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊堿基序列，轉錄出RNA后，RNA產物形成特殊結構來終止轉錄。核酸的合成專業(yè)知識培訓