蛋白質(zhì)的定量測(cè)定一——雙縮脲法第1頁(yè)/共25頁(yè)

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第2頁(yè)/共25頁(yè)蛋白質(zhì)含量測(cè)定

引言：蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。第3頁(yè)/共25頁(yè)

目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：物理性質(zhì)：紫外分光光度法?；瘜W(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。其他性質(zhì)：免疫比濁法。第4頁(yè)/共25頁(yè)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定——雙縮脲法實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?/p>

1、學(xué)習(xí)分光光度法原理，了解分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)。

2、掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及方法。

3、了解標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法及其在物質(zhì)定量測(cè)定中的應(yīng)用。第5頁(yè)/共25頁(yè)分光光度法原理

分光光度法，常被用來(lái)測(cè)定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度，其基本原理是根據(jù)Lambert和Beer定律。第6頁(yè)/共25頁(yè)

Lambert定律

一束平行單色光垂直照射于一均勻物質(zhì)（溶液）時(shí)，由于溶液吸收一部分光能，使光的強(qiáng)度減弱，若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光線強(qiáng)度的減弱也愈顯著。設(shè)：入射光強(qiáng)度為I0L表示溶液的厚度（即光程）出射光（透過(guò)光）強(qiáng)度為I根據(jù)輻射能理論推導(dǎo)，I0與I之間關(guān)系為

lg（I0/I）=K1L（1）

K1是常數(shù)，受光線波長(zhǎng)、溶液性質(zhì)、溶液濃度的影響。第7頁(yè)/共25頁(yè)

Beer定律

當(dāng)一束單色光通過(guò)一溶液時(shí)，光能被溶液介質(zhì)吸收一部分，若溶液的厚度不變，則溶液濃度C愈大，光吸收愈大，透射光線強(qiáng)度的減弱也愈顯著，光強(qiáng)度減弱的量與溶液濃度增加量成正比

lg（I0/I）=K2C（2）

K2為吸收系數(shù)，是常數(shù)，溶液對(duì)光吸收的大小與溶液濃度C成正比。第8頁(yè)/共25頁(yè)

Lambert-Beer定律（又稱吸收定律）

上二式合并（即（l）與（2）合并）

lg（I0/I）=CL令A(yù)=lg（I0/I），T=I/I0

；則A=CL，A=-lgT。

T為透光率，A為吸光度（光密度、消光度）。其中為常數(shù)，又稱消光系數(shù)（extinctioncoefficient），表示物質(zhì)對(duì)光線吸收的能力，其值因物質(zhì)種類和光線波長(zhǎng)而異。對(duì)于相同物質(zhì)和相同波長(zhǎng)的單色光則消光系數(shù)不變。第9頁(yè)/共25頁(yè)分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)

光源：鎢燈和氫燈（或氘燈）單色器：分解為單一波長(zhǎng)光的裝置狹縫：調(diào)節(jié)入射單色光的強(qiáng)度，形成平行光線吸收池：又稱比色杯、比色皿、比色池，裝待測(cè)溶液用檢測(cè)系統(tǒng)：感受光能，轉(zhuǎn)化為電能，輸出A值、T值。第10頁(yè)/共25頁(yè)本室?guī)最惙止夤舛扔?jì)22PC型可見(jiàn)光分光光度計(jì)UNICO2000型第11頁(yè)/共25頁(yè)S54型紫外分光光度計(jì)UV8500型紫外分光光度計(jì)第12頁(yè)/共25頁(yè)比色杯（比色皿）玻璃比色杯石英比色杯熒光比色杯第13頁(yè)/共25頁(yè)比色杯使用注意事項(xiàng)1、拿取比色皿時(shí)，只能用手指接觸兩側(cè)的毛玻璃，避免接觸光學(xué)面。

2、不得將光學(xué)面與硬物或臟物接觸。盛裝溶液時(shí)，高度為比色皿的2/3處即可，光學(xué)面如有殘液可先用濾紙輕輕吸附，然后再用檫鏡紙擦拭。

3、比色皿在使用后，應(yīng)立即用水沖洗干凈。必要時(shí)可用1：1的鹽酸浸泡，然后用水沖洗干凈。

4、不能將比色皿放在火焰或電爐上進(jìn)行加熱或干燥箱內(nèi)烘烤；

5、在測(cè)量時(shí)如對(duì)比色皿有懷疑，可自行檢測(cè)。第14頁(yè)/共25頁(yè)微量移液器吸嘴裝在吸液桿上，應(yīng)套牢避免間隙。依據(jù)所需容量旋轉(zhuǎn)手輪，使數(shù)輪顯示所需值。輕輕地將推動(dòng)按鈕下壓，使推動(dòng)按鈕推移至第一停點(diǎn)位置。手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度為2-4mm，停留2-3秒后緩慢放松按鈕，即回到原來(lái)位置，溶液吸入后稍停即可將吸嘴移出液面。將取液器吸嘴置于排液容器內(nèi)。使吸嘴尖緊貼容器內(nèi)壁，按壓推動(dòng)按鈕至第二停點(diǎn)位置，使溶液排盡，松開(kāi)按鈕。移液完畢，按壓卸嘴按鈕，將吸嘴脫卸。第15頁(yè)/共25頁(yè)【實(shí)驗(yàn)原理】具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，因此蛋白質(zhì)在堿性溶液中，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。

第16頁(yè)/共25頁(yè)紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)為：

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但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有H2NOC-NH-CONH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽(yáng)性。

第18頁(yè)/共25頁(yè)【實(shí)驗(yàn)材料】1．試劑（1）雙縮脲試劑：取1.50g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O），用500mL水溶解，在攪拌下加入300mL10％氫氧化鈉溶液，1.0gKI；用水稀釋到1000mL，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中），避光保存。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色或暗紅色沉淀出現(xiàn)，則需重新配制。

第19頁(yè)/共25頁(yè)2．標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：（1）

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標(biāo)準(zhǔn)用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。第20頁(yè)/共25頁(yè)（2）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：測(cè)定血清等樣品時(shí)需做適當(dāng)稀釋，使其濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試范圍內(nèi)。3．器材

試管、試管架、刻度吸管、微量移液器、旋渦混合器、22PC型、UNICO2000型可見(jiàn)分光光度計(jì)、S54型、UV-8500型紫外分光光度計(jì)。第21頁(yè)/共25頁(yè)【實(shí)驗(yàn)方法】1．制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6支干燥潔凈試管編號(hào)，按下表加入下列試劑：

加入物（ml）

012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml00.20.40.60.81.0蛋白濃度/(mg/ml)

02.04.06.08.010.0蒸餾水/ml

1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑/ml

4.04.04.04.04.04.0充分混勻后，室溫下（20—25℃）放置30min

A540

第22頁(yè)/共25頁(yè)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，即A540(540nm吸光度值)為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．樣品測(cè)定取2支試管，加入待測(cè)樣品液各1ml，加入雙縮脲試劑4ml，室溫下（20—25℃）放置30min，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。3.結(jié)果由測(cè)得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品濃度。以mg/ml計(jì)