內(nèi)毒素檢驗講稿第1頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日細菌內(nèi)毒素試驗試劑：細菌內(nèi)毒素國家標準品、細菌內(nèi)毒素工作標準品、鱟試劑、細菌內(nèi)毒素檢查用水主要設(shè)備：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、旋渦混合器。第2頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗前準備器具處理試驗所用器皿需經(jīng)處理除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。玻璃器皿置電熱干燥箱內(nèi)180℃干烤至少2h或250℃干烤至少30min。塑料器皿置30%雙氧水中浸泡4h，再用細菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗后置60℃烘干備用。第3頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日內(nèi)毒素限值的確定輸液、輸血、注射器具細菌內(nèi)毒素限值在產(chǎn)品標準中規(guī)定，宜盡可能低；推薦輸液、輸血、注射器具細菌內(nèi)毒素限量每件不超過20EU；與腦脊液接觸和胸內(nèi)應(yīng)用醫(yī)療器械每件不超過2.15EU。根據(jù)每件的限值L及每件器械所用的提取液體積V，就可估算所需的鱟試劑靈敏度λ=L/V第4頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗前準備鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。試驗步驟按《中國藥典(二部）附錄中“細菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定進行。第5頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)平行管數(shù)結(jié)果舉例A無/供試品溶液——2C2λ/檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ每個濃度均為4管++++++++--------D無/檢查用水——2鱟試劑靈敏度復(fù)核λc=antilg（ΣX/4）其中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值當λc在0.5λ至2λ（包括0.5λ和2λ）時，鱟試劑靈敏度有效第6頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗前準備供試品干擾試驗對未知或可疑的供試品初次進行細菌內(nèi)毒素試驗之前應(yīng)先進行干擾試驗，以檢驗供試品對細菌內(nèi)毒素試驗是否有抑制或增強作用，以及其他影響細菌內(nèi)毒素試驗準確性和敏感性的干擾作用。當鱟試劑、供試品來源、供試品配方或生產(chǎn)工藝有變化或其他任何可能影響細菌內(nèi)毒素試驗結(jié)果的試驗條件改變時，應(yīng)重新進行干擾試驗。第7頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗前準備每種醫(yī)療器械產(chǎn)品應(yīng)取3批并分別使用不少于兩個制造商生產(chǎn)的鱟試劑進行干擾試驗。試驗步驟按《中國藥典（二部）附錄“細菌內(nèi)毒素檢查法”中“凝膠法”規(guī)定進行。第8頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)平行管數(shù)結(jié)果舉例A無/供試品溶液——2B2λ/供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ每個濃度均為4管++++++-+---+----C2λ/檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ每個濃度均為4管++++++++--------D無/檢查用水——2干擾試驗溶液的制備第9頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日干擾試驗Es=antilg（ΣXs/4）其中Xs為C溶液反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值Et=antilg（ΣXt/4）其中Xt為B溶液反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值當Es在0.5λ至2λ（包括0.5λ和2λ）及當Et在0.5λ至2λ（包括0.5λ和2λ）時，認為供試液濃在該濃度下無干擾作用第10頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗前準備供試品如對細菌內(nèi)毒素試驗有干擾作用，可選用下列適宜方法排除干擾a)使用更靈敏的鱟試劑對供試液進行更大倍數(shù)稀釋;b)采用無熱原氨基甲燒緩沖液稀釋供試液；c)采用無熱原氫氧化銷或鹽酸溶液調(diào)節(jié)供試液pH值在6.0~8.0范圍內(nèi)；d)采用陽離子緩沖液(MgSO4或MgCl2)稀釋供試液以調(diào)節(jié)離子濃度。第11頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）MVD=cL/λL為限值c為供試品溶液濃度第12頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗方法供試品數(shù)量：同一批號至少3個單位供試品漫提介質(zhì)：細菌內(nèi)毒素檢查用水第13頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗方法供試液制備根據(jù)產(chǎn)品標準規(guī)定的細菌內(nèi)毒素限值確定浸提介質(zhì)體積，選用下列適宜方法制備供試液:a)管類和容器類器具用細菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡器具內(nèi)腔，在(37±1)℃恒溫箱中浸提不少于1h；B)小型配件或?qū)嶓w類器具置無熱原玻璃器皿內(nèi)，加入細菌內(nèi)毒素檢查用水振搖數(shù)次，在37±1℃恒溫箱中浸泡不少于1h；供試液貯存應(yīng)不超過2h第14頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗方法浸提介質(zhì)體積計算公式：V=L/λ式中：V—浸提介質(zhì)體積，單位為毫升(mL);L—產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素限值，單位為細菌內(nèi)毒素單位每件(EU/件)λ—所用鱟試劑靈敏度標示值，單位為細菌內(nèi)毒素單位每毫升(EU/mL)第15頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/檢查用水2D無/檢查用水2A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。第16頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日結(jié)果判斷37℃±1℃保溫60分鐘后觀察結(jié)果D管的結(jié)果均為陰性，B、C管的結(jié)果均為陽性時試驗有效A的2個平行管均為陰性時判定供試品符合規(guī)定A的2個平行管均為陽性時判定供試品不符合規(guī)定A的2個平行管1管陽性1管陰性時需進行復(fù)試。復(fù)試時A液需做4管，全部陰性判定為符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定第17頁，共19頁，2023年，2月20日，星期日試驗報告試驗報告中宜給出下列信息:a)供試品名稱;b)生產(chǎn)批號;c)供試液制備方法;d)細菌內(nèi)毒素限