基因工程工具酶及應(yīng)用工具酶種類(lèi)限制性內(nèi)切酶—用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化修飾核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類(lèi)—用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測(cè)等。限制性內(nèi)切核酸酶

Restrictendonuclease

I型：由三個(gè)基因編碼，即：hsd

R；hsd

M；hsd

S(hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity)位于染色體上，三個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體(同一操縱子)，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(S-腺苷蛋氨酸)。

II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨(dú)立起作用，在E.coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。

III型：修飾酶與I型酶相同，hsd

M與hsd

S基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨(dú)立存在的。上述三個(gè)系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，被廣泛用于基因工程中。

限制修飾系統(tǒng)的種類(lèi)定義：廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶；狹義指II型限制酶。命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。

例如：HindIII

前三個(gè)字母來(lái)自于菌種名稱(chēng)H.influenzae，“d”表示菌系為d型血清型；“III”表示分離到的第三個(gè)限制酶。

EcoR

I—Escherichiacoli

RI

HindIII—Haemophilus

influensae

dIII

Sac

I(II)—Streptomyces

achromagenes

I(II)限制性內(nèi)切酶的定義、命名第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名EcoRI

屬

種

株

序Escherichia

coli

RY13株大腸桿菌RY13株的第一種酶--對(duì)稱(chēng)性—雙對(duì)稱(chēng)

EcoRI5’-GAATTC-3’

3’-CTTAA

G-5’

--切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外--限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端:5’-P和3’-OH3’-端突起PstI

5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAOH

PG-3’3’-GACGTC-5’3’-GP

HOACGTC-5’

5’-端突起EcoRI

5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

3’-CTTAAP

HOG-5’平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’非互補(bǔ)的粘性末端切點(diǎn)在識(shí)別順序之外的，如：FokI

5’-GGATG(N)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(N)13-5’3’-CCTAC(N)13

能識(shí)別簡(jiǎn)并順序的，如：AvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

相容性末端如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN

它們產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識(shí)別和酶切，但BamHI和BglII的識(shí)別機(jī)率只有1/16。BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識(shí)別和酶切。特點(diǎn):限制酶識(shí)別序列特異性降低

發(fā)生星活性的限制酶和條件(見(jiàn)下一張)

星活性的利用和避免限制性內(nèi)切酶活性單位的定義：1個(gè)單位(u)酶指在建議使用的緩沖液及溫度下，在20μl反應(yīng)體系中反應(yīng)1小時(shí)，使1μgDNA完全消化所需的酶量(多數(shù)情況下用λDNA來(lái)測(cè)試)限制酶的星活性(staractivity)表1具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識(shí)別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeIII2,4HhaI2,4,7HindIII6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuII2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstII2,4XbaI2,4,7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亞砜(8%);8:無(wú)NaCl。

DNA重組限制酶（物理）圖譜繪制突變分析（RFLP分析）限制酶的用途幾個(gè)在分子克隆中應(yīng)注意使用內(nèi)切酶：

CH3DpnI:GATC

SapI:GCTCTTCNNNN

CTAG

CGAGAAGNNNN

CH3

限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：在DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識(shí)別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同。如：不同:M.EcoRIGAmATTCC

EcoRIGAATTC相同:M．HpaIC

mCGG

Hpa

ICCGG甲基化酶的種類(lèi)與識(shí)別順序

E．coli

的兩類(lèi)甲基化酶

Dam:

G

mATC(甲基化位點(diǎn)為N6)

Dcm:

C

mCA/TGG

(甲基化位點(diǎn)為C5)

哺乳動(dòng)物的甲基化酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程有關(guān)。

E．coli中依賴(lài)于甲基化的限制修飾系統(tǒng)Mrr(mA/A)、mcr(Am5CG)、merB(Pum5C)

Dcm

和Dam甲基化酶對(duì)限制酶的影響抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識(shí)別順序是完全重疊還是邊界重疊如：完全重疊Bcl

I—Dam(GATC)；ScrFI—Dcm(CCA/TGG)

邊界重疊Cla

I—Dam；Sau96I—Dcm不能抑制某些限制酶活性，不管兩者的識(shí)別順序?yàn)楹畏N重疊如：Dam—BamHI，Sau3AI，Bgl

II，Pvu

I；

Dcm—BstNI甲基化酶活性對(duì)限制酶活性的影響抑制同種限制酶的活性

M.BamHI

GGATmCC—BamHI(GGATCC)

M.EcoRI

GAmATTC—EcoRI(GAATTC)

抑制不同種限制酶的活性

a.順序完全重疊如：M.Cla

I(ATCGmAT)—Taq

I(TCGmA)

b.順序邊界重疊如：M.BamH

I(GGATmCC)—Mep

I(mCCGG)

抑制不同種限制酶的部分活性

M.

Taq

I(TCGmA)—HindII(GTPyPuAC)：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC

II型甲基化酶對(duì)限制酶活性的影響改變某些限制酶識(shí)別順序的特異性，以便重組體的形成在建立基因文庫(kù)時(shí)，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切甲基化酶的用途表3甲基化酶與識(shí)別序列甲基化酶識(shí)別序列a受甲基化影響的限制酶b

M.AluIAGmCTAluI,BamHII,Bsp1286

DdeI,HgiAI,NheI,PstIM.BamHIGGATmCCBamHI,MspIM.ClaIATCGmATClaI,MboI,TaqIdamGmATCc

dcmCCA/TGGc

M.EcoRIGAmATTCEcoRIM.HIdGCNGCGGmCCMstI,PstI,PvuIIM.HaeIIIGGmCCBanII,BglI,Bsp1286,BstXI,HaeIII,

MspI,NaeI,NcoI,SacII,Sau96IM.HhaIGmCGCAhaII,FnuDII,HhaIM.HpaIICmCGGAhaII,AvaI,AvaII,HpaII,ScrFIM.HphITmCACCHinfI,HphI,Sau3AIM.MspImCCGGBamHI,MspIM.PstICTGCmAGAluI,PstIM.TaqITCGmAAluI,AvaI,EcoRV,HinCII,HinfI,

MboI,TaqI,XmnIa.標(biāo)在堿基的左上角的m表示該堿基被甲基化;b.所列出的限制酶均已商品化;c.參見(jiàn)表2;d.M.HI分離自噬菌體污染的細(xì)菌細(xì)胞，它可識(shí)別兩個(gè)序列，GCNGC的甲基化位點(diǎn)尚未確定。核酸酶Nuclease

ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于順序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA標(biāo)記

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。--RNaseA分離自牛胰臟，對(duì)熱穩(wěn)定，抗去污劑(100℃加熱15min仍具活性),用于除去DNA樣品中的RNA分子

--核酸酶S7，亦稱(chēng)微球菌核酸酶，對(duì)RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA

RNase作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫(kù)建立時(shí)除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。RNaseH特點(diǎn)：具內(nèi)切酶活性，作用于ds-DNA，但無(wú)核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+

或Ca2+,Mn2+可使酶活達(dá)最大值,當(dāng)酶濃度很低時(shí)，ds-DNA分子上將形成切口，不同類(lèi)型二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口獨(dú)立無(wú)關(guān)Mn2+存在時(shí)，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置用途

1)切口移位，制備DNA探針

2)制備RNA樣品時(shí)除去DNA分子

3)基因突變時(shí)產(chǎn)生切口

DNaseIMn++存在時(shí)Mg++存在時(shí)

DNaseI作用特點(diǎn)DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolIDNA聚合酶DNApolymerase

E.coli

的DNA聚合酶系統(tǒng)

PolI參與DNA修復(fù),具3’→5’和5’→3’外切酶活性

polII同上具3’→5’外切酶活性

polIII參與DNA復(fù)制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

E.coliDNA聚合酶I(polI)E.coli

polI的特點(diǎn)

--具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱(chēng)為Klenow片段,polIK)--聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響

--外切酶活性

用途

--除去3’-端突起的單鏈DNA（在無(wú)dNTP時(shí)）

--補(bǔ)齊5’-突起端

--合成第二條cDNA--切口移位制備探針特點(diǎn)：

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為polI的兩倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min用途：

制備高比活性探針(1010

cpm/μgDNA);DNA末端修飾---缺失T4DNA聚合酶

外切酶活性聚合酶活性

無(wú)dNTPdNTP·AMV(Avianmyeloblastosisvirus)反轉(zhuǎn)錄酶

--結(jié)構(gòu)與酶活性反轉(zhuǎn)錄酶以α，αβ，ββ形式存在，其中β(無(wú)活性)→P32(內(nèi)切酶活性)+α→聚合酶+P24(RNaseH活性)，各步反應(yīng)由蛋白酶催化

--聚合酶活性a.RNA，DNA引物(大于8nt)→cDNA鏈b．DNA，RNA引物→互補(bǔ)DNA鏈

反轉(zhuǎn)錄酶·

M-MuLV(Moloneymurineleukemiavirus)反轉(zhuǎn)錄酶

--特點(diǎn)：

不具內(nèi)切酶活性;RNaseH活性低;穩(wěn)定性差

--與AMV反轉(zhuǎn)錄酶比較

a．合成短鏈cDNA(0.6kb)時(shí)，兩者相同，但M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關(guān)b．合成長(zhǎng)鏈cDNA(4.5-7.5kb)時(shí)，它比AMV反轉(zhuǎn)錄酶有效得多，這與它無(wú)內(nèi)切酶活性有關(guān)。

--用途

a.cDNA合成，建立文庫(kù);b.制備cDNA探針;c.DNA序列分析;d.填補(bǔ)5’-突起末端以獲平端特點(diǎn)：

分離自古細(xì)菌嗜熱水生菌(Thermus

aquaticus)，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對(duì)95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性，錯(cuò)配幾率為8.9x10-5~1.1x10-4。

TaqDNA聚合酶用途：

主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個(gè)DNA分子因而可被擴(kuò)增4×106倍

DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個(gè)步驟：

DNA模板變性(95℃)→與DNA引物退火(45~60℃)→引物延伸(72℃)

TaqPol和PCR

5’3’變性

3’5’5’3’引物3’5’復(fù)性5’3’5’3’3’5’引物3’5’5’3’延伸5’3’3’5’3’5’

VentDNApol:由火山口分離的嗜熱高溫球菌中分離，具有3’→5’外切酶活性，具有較高的保真度(比TaqDNApol高5~15倍)。PfuDNApol:來(lái)自激烈熱球菌(Pyrococcus

fariosus)，具有3’→5’外切酶活性，具有更高的保真度。

其它DNA聚合酶RNA聚合酶RNApolymerase

特點(diǎn)：

依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶，具SP6啟動(dòng)子特異型用途：

主要用于RNA分子的體外合成，RNA分子可用于：

--RNA分子的拼接研究;--標(biāo)記的RNA常用于雜交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更穩(wěn)定，兩條鏈均可標(biāo)記，產(chǎn)生的RNA具高放射比活性;

SP6RNA聚合酶--DNA的定序分析;--基因結(jié)構(gòu)的研究，其中包括內(nèi)含子數(shù)目，長(zhǎng)度和位置;--還可以用于蛋白質(zhì)的合成研究.連接酶Ligase

特點(diǎn)：

只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

用途：

--相同或相容粘性末端的連接;--平末端的相連;DNA平端來(lái)源：限制酶作用結(jié)果;限制酶與其它酶共同作用結(jié)果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多!抑制劑：PO43->5mM;NaCl>25mM;Ca2+>0.1mMT4DNA連接酶活力單位：一般采用Weiss單位來(lái)定義其活性：在37℃下20min催化1nmol

32P從焦磷酸根置換到[γβ32P]ATP所需的酶量。而NEB連接酶單位定義為：在20μl反應(yīng)體系中于16℃，使HindIII切過(guò)的λDNA(300μg/ml)在30min內(nèi)連接50%所需的酶量為1NEB單位。1NEB單位=0.015Weiss單位，1Weiss單位=67NEB單位。反應(yīng)條件：

--16

℃、4h--4

℃、O/N(overnight)--RT℃、

5min(特殊設(shè)計(jì))5’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP

退火5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’或

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

T4DNA連接酶5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’或

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’T4DNA連接酶的連接反應(yīng)(兩種插入方向)

+只能連接具粘性末端DNA分子，以NAD作輔助因子E.coliDNA連接酶參與單鏈RNA分子的連接。主要用于提高T4DNA連接酶在連接反應(yīng)中的連接效率（20倍）

HOPHOPHOP5’3’5’3’5’3’

RNA連接酶活性

T4RNA連接酶核酸末端修飾酶特點(diǎn)

--除去ss-DNA，ds-DNA和RNA分子兩端的3’-和5’-磷酸基;--對(duì)熱穩(wěn)定.用途

--載體DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率;--核酸末端標(biāo)記.

細(xì)菌堿性磷酸酶(Bacterialalkalinephosphatase,BAP)

[γ-32P]ATPATP

5’POH3’5’

32P

OH3’3’HOP5’3’HO

32P

5’

III

5’POH3’5’HOOH3’5’POH3’3’HOP5’3’HOOH5’3’HO