應用鼠疫菌全基因組芯片

研究

黃連抑菌機制的方法國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：李書寶.中國鼠疫監(jiān)測現(xiàn)狀及疫情態(tài)勢分析俞東征.我國鼠疫形勢與鼠疫控制策略沈爾禮,張葦,高崇華,等.關于美國、秘魯鼠疫防治工作的考察報告[J].HoltRD,DobsonAP,BegonM,etal.Parasiteestablishmentinhostcommunities[J].EcologyLetters,2003,6(9):8372842.PowerAG,MitchellCE.Pathogenspilloverindiseaseepidemics[J].AmericanNaturalist,2004,164Suppl:S79288.目的:建立一種應用鼠疫耶爾森菌全基因組芯片研究黃連對鼠疫耶爾森菌抑制作用分子機制的方法。方法:應用液體稀釋法測定黃連對鼠疫耶爾森菌的最小抑菌濃度(MIC)；鼠疫耶爾森菌全基因組芯片包含4005條鼠疫耶爾森菌基因。基因芯片表達譜實驗中黃連作用鼠疫耶爾森菌的濃度為10×MIC，作用時間為30min；提取并純化鼠疫耶爾森菌總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；Cy3、Cy5染料標記后，與鼠疫耶爾森菌全基因組芯片雜交；通過芯片掃描儀獲得表達譜分析結果。應用SAM軟件處理結果，應用SAM軟件處理結果。立項依據(jù)：鼠疫耶爾森菌(以下簡稱鼠疫菌)可以引起烈性傳染病一鼠疫鼠疫，菌對常規(guī)的抗生素敏感，鏈霉素、氯霉素及四環(huán)素是鼠疫菌治療的首選藥物?？股氐挠行褂煤芎玫乜刂屏耸笠叩陌l(fā)生、流行以及蔓延。鏈霉素耐藥株的出現(xiàn)使得鼠疫菌治療藥物研究變得尤為迫切。不斷探索新的治療藥物是擺在每一位鼠疫防治工作者面前的光榮使命。前期的研究結果表明，在傳統(tǒng)中藥中黃連對鼠疫菌有較強的抑菌作用。為了繼續(xù)深入探討黃連抑制鼠疫菌的作用機制，探索黃連應用于鼠疫預防與治療的可能性，通過應用鼠疫菌全基因組芯片建立研究黃連抑制鼠疫菌分子機制的方法。哈爾濱1910年特大鼠疫1．

2黃連作用鼠疫菌最小抑菌濃度(MIC)的測定黃連作用于鼠疫菌的MIC測定采用液體稀釋法進行。準備系列含有1mlTMH液體培養(yǎng)基的試管，將黃連配制成相應濃度后加入含有培養(yǎng)基的試管中，以2倍比稀釋法逐管稀釋黃連，最終各管黃連的濃度分別為0．1、0．05、0．025、0．0125、0．00625g／ml,在每個試管中加入1．5X10^8CFU／ml的細菌10ul,試驗設空白及重復對照,28℃培養(yǎng)24h后，分別轉(zhuǎn)種普通瓊脂平板培養(yǎng)基，觀察細菌在平板培養(yǎng)基的生長現(xiàn)象，無細菌生長的試管濃度為黃連作用鼠疫菌的MIC。1．3鼠疫菌基因芯片表達譜實驗1．3．1實驗分組選擇黃連作用鼠疫菌組作為試驗組，等量生理鹽水相同條件作為對照組，進行基因芯片表達譜試驗。黃連作用鼠疫菌的作用濃度為10×MIC。作用時間為30min。實驗分組應用系列重復設置，包括2個生物重復，以及2個技術重復。對不同分組采用不同熒光素交換標記。1．3．2鼠疫菌RNA提取應用細菌RNA保護劑(QiagenInc)分別對實驗組與對照組細菌進行保護，保證細菌mRNA停留在進行保護的時刻。分別應用MasterPureTMRNA提取試劑盒(EpicentreInc)進行實驗組與對照組鼠疫菌的總RNA提取，提取RNA后通過分光光度計與凝膠電泳鑒定提取RNA的質(zhì)與量。

1．3．4芯片雜交與掃描雜交探針分別置于95℃變性5min，然后立即將探針加在芯片上，蓋玻片封片置于雜交爐內(nèi)42℃雜交16h。然后依次以2×SSC+O．2％SDS溶液、0．1％SSC+0．2％SDS溶液及0．1％SSC溶液各洗滌2min，電吹風吹干。用ScanArray4100掃描儀掃描芯片。1．3．5結果分析利用GenePixPro4．1軟件對掃描的熒光信號進行處理，首先確定樣點信號和背景噪音，計算各個樣點扣除背景后的熒光信號值。剔除雙通道熒光信號中值小于2倍背景值的數(shù)據(jù)，再采用整體歸一法對雙色熒光數(shù)據(jù)進行歸一化處理。應用SAM軟件對獲得數(shù)據(jù)進行分析。

結果：2．1黃連作用鼠疫菌MIC的檢測黃連作用于鼠疫菌的最小抑菌濃度MIC為0．025ml，對鼠疫森菌有較強的抑菌作用。2．2芯片雜交芯片雜交后，啟動激光共聚焦掃描儀Genepix4100A的掃描程序，分別用波長635nm和532nm進行雙通道掃描，讀取熒光信號后將圖保存。數(shù)據(jù)通過SAM軟件分析，共獲得黃連作用鼠疫菌差異基因360個，其中上調(diào)333個，下調(diào)27個。如肺炎雙球菌、白喉桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌；大腸桿菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌、淋球菌等革蘭陰性菌；以及白色念珠菌、紅色毛癬菌等真菌。黃連的分布地區(qū)較廣，栽培簡便，資源豐富。因此，對黃連進行深入研究，擴大其藥效作用，將有很大的社會效益和廣泛的開發(fā)前景?；蛐酒夹g的發(fā)展為進行黃連的分子藥理學分析提供了一個有力的平臺?；蛐酒前殡S著人類基因組計劃發(fā)展起來的一項高通量篩選技術，具有大規(guī)模、高通量和高平行等