核酸的生物合成ppt核酸的生物合成ppt第1頁一、DNA生物合成

（一）DNA自我復(fù)制

1.DNA復(fù)制特點(diǎn)（1）半保留復(fù)制

1953年，Watson和Crick提出DNA半保留復(fù)制假說：DNA復(fù)制時(shí)，以親代DNA每一條鏈作模板，合成完全相同兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。

核酸的生物合成ppt第2頁□1958年Meselson&stahl用同位素（15N）示蹤標(biāo)識(shí)加密度梯度離心技術(shù)試驗(yàn),該試驗(yàn)跟蹤了生長(zhǎng)了三代大腸桿菌，證實(shí)了DNA是采取半保留方式進(jìn)行復(fù)制。MesselsonStahl核酸的生物合成ppt第3頁“Heavy”DNA“Hybrid”

DNA“l(fā)ight”DNA“Hybrid”DNA核酸的生物合成ppt第4頁（2）從復(fù)制起始點(diǎn)開始，多雙向進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，在一些含有特定核苷酸排列次序位點(diǎn)起始，即復(fù)制起始點(diǎn)。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。

DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制（在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制，如滾環(huán)復(fù)制）。核酸的生物合成ppt第5頁（3）半不連續(xù)復(fù)制因?yàn)镈NA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈方向必須為3’→5’。所以，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)方式是不一樣。以3’→5’方向親代DNA鏈作模板子代鏈在復(fù)制時(shí)基礎(chǔ)上是連續(xù)進(jìn)行，其子代鏈聚合方向?yàn)?’→3’，這一條鏈被稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。核酸的生物合成ppt第6頁以5’→3’方向親代DNA鏈為模板子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)，其鏈聚合方向也是5’→3’，這條鏈被稱為后隨鏈(laggingstrand)。核酸的生物合成ppt第7頁因?yàn)橛H代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開，所以，后隨鏈合成也是一段一段。DNA在復(fù)制時(shí)，由后隨鏈所形成一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段大小，在原核生物中約為1000～個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100-200個(gè)核苷酸。

核酸的生物合成ppt第8頁2.DNA復(fù)制條件

（1）原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、

dCTP、dTTP)。（2）模板：以DNA兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA。（3）引物：DNA合成需要一段RNA鏈作為引物。（4）還需要各種蛋白質(zhì)：

核酸的生物合成ppt第9頁●

解螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶解螺旋酶(unwindingenzyme)，又稱解鏈酶，是用于解開DNA雙鏈酶蛋白，每解開一對(duì)堿基，需消耗2分子ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可使DNA雙鏈中一條鏈切斷，松開雙螺旋后再將DNA鏈連接起來。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ可切斷DNA雙鏈，使DNA超螺旋松解后，再將其連接起來。核酸的生物合成ppt第10頁●單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）:能夠與單鏈DNA結(jié)合。其作用為：①使解開雙螺旋后DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護(hù)單鏈DNA，防止核酸酶降解。核酸的生物合成ppt第11頁●

DNA聚合酶

在原核生物中，當(dāng)前發(fā)覺DNA聚合酶有三種，分別命名為DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）、DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）、DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），這三種酶都屬于含有各種酶活性多功效酶。參加DNA復(fù)制主要是polⅢ和polⅠ。核酸的生物合成ppt第12頁真核生物DNA聚合酶有五種：DNA聚合酶α(polα)，β(polβ)，γ(polγ)，δ(polδ)和ε(polε)。參加染色體DNA復(fù)制是polα(后隨鏈)和polδ(前導(dǎo)鏈)，參加線粒體DNA復(fù)制是polγ，polε與DNA損傷修復(fù)、校正和填補(bǔ)缺口相關(guān)，polβ只在其它聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。核酸的生物合成ppt第13頁DNA聚合酶大腸桿菌和哺乳動(dòng)物DNA聚合酶比較PolⅠPolⅡPolⅢPolPolPolPolPol5’3’聚合酶活性5’3’外切酶活性3’5’外切酶活性主要功效++++++++++++++++———除去后隨鏈上RNA引物，填補(bǔ)缺口DNA修復(fù)合成中新鏈延伸后隨鏈合成核DNA修復(fù)線粒體DNA復(fù)制前導(dǎo)鏈合成DNA修復(fù)大腸桿菌哺乳動(dòng)物核酸的生物合成ppt第14頁●

DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)可將后隨鏈上岡崎片段之間切口連接起來（DNA片段之間形成磷酸二酯鍵）。反應(yīng)需要能量。NAD+NMN+AMPATPPPi+AMP細(xì)菌中：動(dòng)物或噬菌體：核酸的生物合成ppt第15頁3.DNA復(fù)制過程

（1）解旋解鏈，形成復(fù)制叉由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。SSB結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。

DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。核酸的生物合成ppt第16頁核酸的生物合成ppt第17頁（2）引發(fā)由蛋白因子（如DnaB等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其它蛋白因子、引物酶一起組裝形成引發(fā)體。在引物酶催化下，以DNA為模板，合成一段短RNA片段，從而取得3'端自由羥基（3'-OH）。

核酸的生物合成ppt第18頁（3）延長(zhǎng)

由DNA聚合酶催化，前導(dǎo)鏈從5’→3’方向連續(xù)聚合子代DNA鏈，后隨鏈則按5’→3’方向合成一個(gè)個(gè)短岡崎片段。核酸的生物合成ppt第19頁ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeatures核酸的生物合成ppt第20頁去除引物，填補(bǔ)缺口：在原核生物中，DNA聚合酶Ⅰ(5’→3’外切酶活性)水解去除RNA引物，并由該酶催化延長(zhǎng)引物缺口處DNA，直到剩下最終一個(gè)磷酸酯鍵切口。在真核生物中，RNA引物去除，由一個(gè)特殊核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長(zhǎng)。核酸的生物合成ppt第21頁*在合成過程中，假如插入了一個(gè)錯(cuò)配核苷酸，DNApolⅠ、DNApolⅢ就能識(shí)別、并除掉錯(cuò)配核苷酸（3’5’外切酶活性）

(4)連接岡崎片段在DNA連接酶催化下，形成最終一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整DNA長(zhǎng)鏈。核酸的生物合成ppt第22頁

真核生物細(xì)胞中DNA復(fù)制除了多起始點(diǎn)、聚合酶種類不一樣外，還有一個(gè)不一樣于原核細(xì)胞之處：端粒形成：端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端膨大成粒狀結(jié)構(gòu)。其共同結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C短重復(fù)序列組成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。

核酸的生物合成ppt第23頁線性DNA在復(fù)制完成后，其末端因?yàn)橐颮NA水解可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）催化下，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。端粒酶是一個(gè)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它能以RNA為模板，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程對(duì)末端DNA鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。正常細(xì)胞中端粒酶活性較低，細(xì)胞每分裂一次端粒就變短一點(diǎn)，到一定程度細(xì)胞就衰老死亡；癌細(xì)胞中端粒酶活性較高，所以，癌細(xì)胞不易死亡。

核酸的生物合成ppt第24頁端粒酶(telomerase)作用機(jī)制移位作用核酸的生物合成ppt第25頁(二)反轉(zhuǎn)錄作用1970年，Temin和Baltimore發(fā)覺致癌RNA病毒中存在反轉(zhuǎn)錄酶（“逆轉(zhuǎn)錄酶”），為此榮獲1976年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。依賴于RNADNA聚合酶稱為反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶催化、以RNA為模板合成互補(bǔ)DNA過程稱為反轉(zhuǎn)錄。核酸的生物合成ppt第26頁在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，以RNA為模板合成、與RNA堿基序列互補(bǔ)DNA稱為互補(bǔ)DNA(cDNA)。反轉(zhuǎn)錄時(shí)引物：一段連接在單鏈RNA模板上RNA或DNA。反轉(zhuǎn)錄時(shí)新鏈延伸方向：5’→3’核酸的生物合成ppt第27頁mRNARNA-DNA雜交分子cDNA雙鏈加入dNTP和短oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄酶polⅠKlenow片段RNaseHS1核酸酶（催化合成第二條DNA鏈）（把RNA鏈降解）（可打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并把雙鏈DNA分子兩端切平）（與polyA配對(duì)，作為引物提供3’-OH）核酸的生物合成ppt第28頁（三）DNA損傷和修復(fù)

1.DNA損傷產(chǎn)生盡管DNA聚合酶含有高度準(zhǔn)確聚合反應(yīng)和高效校正功效，但DNA復(fù)制時(shí)，還可能發(fā)生堿基錯(cuò)誤配對(duì)，如大腸桿菌每104~105bp中約有一個(gè)錯(cuò)配出現(xiàn)。另外，細(xì)胞正常生理活動(dòng)也能夠引發(fā)DNA自發(fā)性損傷。常見DNA損傷包含堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈斷裂、重組等。*引發(fā)突變?cè)颍?1)自發(fā)原因：自發(fā)脫堿基、自發(fā)脫氨基、復(fù)制錯(cuò)配。

核酸的生物合成ppt第29頁(2)物理原因：由紫外線、電離輻射、X射線等引發(fā)DNA損傷。其中，X射線和電離輻射經(jīng)常引發(fā)DNA鏈斷裂，而紫外線經(jīng)常引發(fā)嘧啶二聚體形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體因?yàn)樾纬闪斯矁r(jià)鍵連接環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而引發(fā)復(fù)制障礙。

（3）化學(xué)原因：脫氨劑（如亞硝酸與亞硝酸鹽）、烷基化劑、DNA加合劑（如苯并芘）、堿基類似物（如5-FU）、斷鏈劑（如過氧化物）核酸的生物合成ppt第30頁基因損傷引發(fā)mRNA閱讀框架內(nèi)堿基發(fā)生插入或缺失，可能造成移碼突變。核酸的生物合成ppt第31頁點(diǎn)突變是指由單個(gè)核苷酸改變引發(fā)突變。點(diǎn)突變能夠分為轉(zhuǎn)換和顛換兩類。

轉(zhuǎn)換：嘌呤和嘌呤之間替換，或嘧啶和嘧啶之間替換。

顛換：嘌呤和嘧啶之間替換。錯(cuò)義突變是指編碼某種氨基酸密碼子經(jīng)堿基替換以后,變成編碼另一個(gè)氨基酸密碼子,從而使多肽鏈氨基酸種類和序列發(fā)生改變。無義突變是指因?yàn)槟硞€(gè)堿基改變使代表某種氨基酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，從而使肽鏈合成提前終止。同義突變或中性突變，不引發(fā)氨基酸替換突變。核酸的生物合成ppt第32頁DNA修復(fù)系統(tǒng)功效錯(cuò)配修復(fù)恢復(fù)錯(cuò)配堿基切除修復(fù)切除突變堿基核甘酸切除修復(fù)重組修復(fù)修復(fù)被破壞DNA復(fù)制后修復(fù)，重新開啟停滯復(fù)制叉DNA直接修復(fù)SOS系統(tǒng)修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNADNA修復(fù)，造成變異2.DNA損傷修復(fù)

核酸的生物合成ppt第33頁1)錯(cuò)配修復(fù)

錯(cuò)配修復(fù)是以模板鏈信息來糾正新合成鏈錯(cuò)配堿基一個(gè)修復(fù)方式?！馜am甲基化酶使母鏈位于5’GATC序列中腺甘酸（N-6）甲基化；●甲基化緊隨在DNA復(fù)制之后進(jìn)行；●依據(jù)復(fù)制叉上DNA甲基化程度，切除還未甲基化子鏈上錯(cuò)配堿基；核酸的生物合成ppt第34頁

依據(jù)母鏈甲基化標(biāo)準(zhǔn)找犯錯(cuò)配堿基示意圖發(fā)覺錯(cuò)配堿基在水解ATP作用下，MutS，MutL與堿基錯(cuò)配點(diǎn)DNA雙鏈結(jié)合MutS-MutL在DNA雙鏈上移動(dòng)，發(fā)覺甲基化DNA后由MutH切開非甲基化子鏈核酸的生物合成ppt第35頁

甲基化指導(dǎo)錯(cuò)配修復(fù)示意圖錯(cuò)配堿基位于切口3’下游端，錯(cuò)配堿基位于切口5’上游端，核酸的生物合成ppt第36頁小結(jié)：大腸桿菌錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制

①M(fèi)utS蛋白與錯(cuò)配堿基結(jié)合，MutH與GATC結(jié)合，MutL使MutS和MutH連結(jié)成復(fù)合體，MutH位點(diǎn)專一核酸內(nèi)切酶活力在未甲基化鏈GATC序列中G5’側(cè)切割。②核酸外切酶在Helicase及SSB幫助下將無甲基化鏈從GATC位點(diǎn)至錯(cuò)配位點(diǎn)整段去除。③若被切割GATC位點(diǎn)在錯(cuò)配位點(diǎn)3‘端，由exoⅠ從3’→5‘將核酸鏈降解。④若被切割GATC位點(diǎn)在錯(cuò)配位點(diǎn)5‘端，則由exoⅦ（3‘→5’或5’→3‘降解單鏈）或RecJ（5’→3‘降解單鏈）從5’→3‘降解核酸鏈。⑤DNApolⅢ及l(fā)igase依據(jù)模板股序列填補(bǔ)新鏈被切除個(gè)別，包含錯(cuò)配堿基。

GATC位點(diǎn)與錯(cuò)配位點(diǎn)距離可能長(zhǎng)達(dá)1000nt以上。所以，為了修復(fù)一個(gè)錯(cuò)配堿基，有時(shí)需重新合成一千個(gè)以上堿基。核酸的生物合成ppt第37頁2)堿基切除修復(fù)一些堿基在自發(fā)或誘變下會(huì)發(fā)生脫酰胺，然后改變配對(duì)性質(zhì)，造成氨基轉(zhuǎn)換突變腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤與胞嘧啶配對(duì)胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對(duì)▲切除修復(fù)（excisionrepair）對(duì)各種DNA損傷包含堿基脫落形成無堿基位點(diǎn)、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復(fù)作用。

核酸的生物合成ppt第38頁鳥嘌呤腺嘌呤黃嘌呤脫氨基次黃嘌呤脫氨基核酸的生物合成ppt第39頁胞嘧啶尿嘧啶脫氨基核酸的生物合成ppt第40頁假如復(fù)制發(fā)生就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)突變核酸的生物合成ppt第41頁.糖苷水解酶識(shí)別改變了堿基，把堿基從N-β-糖苷鍵處切下來，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點(diǎn)，統(tǒng)稱為AP位點(diǎn)。核酸的生物合成ppt第42頁由AP核酸內(nèi)切酶將受損核苷酸糖苷-磷酸鍵切開核酸的生物合成ppt第43頁。DNA連接酶連接利用DNA聚合酶I切除損傷部位，補(bǔ)上核苷酸核酸的生物合成ppt第44頁▲

小結(jié)：堿基切除修復(fù)糖苷水解酶：細(xì)胞中各種能特異切除受損核苷酸上N-β-糖苷鍵，在DNA鏈上形成AP位點(diǎn)(去嘌呤或去嘧啶位點(diǎn))。AP核酸內(nèi)切酶：能在AP位點(diǎn)附近（5`或3`位置）將DNA鏈切開；核酸外切酶：移去包含AP位點(diǎn)核苷酸在內(nèi)小片段DNA；DNA聚合酶I：合成新片段；DNA連接酶：連接切口而修復(fù)。核酸的生物合成ppt第45頁3)核苷酸切除修復(fù)1）經(jīng)過特異核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位；2）由酶復(fù)合物（DNA解鏈酶）在損傷兩邊切除幾個(gè)核苷酸；3）DNA聚合酶（Ⅰ或ε）以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈；4）DNA連接酶將切口補(bǔ)平。核酸的生物合成ppt第46頁識(shí)別損傷部位損傷兩邊切除幾個(gè)核苷酸DNA聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈DNA連接酶將切口補(bǔ)平核酸的生物合成ppt第47頁4)重組修復(fù)(recombinantrepair)

重組修復(fù)又被稱為“復(fù)制后修復(fù)”，他發(fā)生在復(fù)制后。機(jī)體細(xì)胞對(duì)在復(fù)制起始時(shí)還未修復(fù)DNA損傷部位能夠先復(fù)制再修復(fù)，即先跳過該損傷部位，在新合成鏈中留下一個(gè)對(duì)應(yīng)于損傷序列缺口。該缺口由DNA重組來修復(fù)：先從同源DNA母鏈上將對(duì)應(yīng)核苷酸序列片段移至子鏈缺口處，然后再用新合成序列補(bǔ)上母鏈空缺。核酸的生物合成ppt第48頁詳細(xì)來說，①受損傷DNA鏈復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生子代DNA在損傷對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。②完整另一條母鏈DNA與有缺口子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上對(duì)應(yīng)片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口。③以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA缺口，最終由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷DNA段落依然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)后合成DNA分子是不帶有損傷，但經(jīng)屢次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞是帶有損傷DNA。

核酸的生物合成ppt第49頁5)DNA直接修復(fù)在DNA光解酶作用下將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體甲基轉(zhuǎn)移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，預(yù)防G-T配對(duì)核酸的生物合成ppt第50頁6)SOS系統(tǒng)

SOS反應(yīng)（SOSresponse)是細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制緊急情況下，細(xì)胞為求得生存而產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急辦法。SOS反應(yīng)包含誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂抑制以及溶原性細(xì)胞釋放噬菌體等，細(xì)胞癌變等，細(xì)胞癌變也與SOS反應(yīng)相關(guān)。含有DNA修復(fù)作用，同時(shí)也是唯一造成突變一個(gè)修復(fù)系統(tǒng)。核酸的生物合成ppt第51頁當(dāng)前對(duì)真核細(xì)胞DNA修復(fù)反應(yīng)類型、參加修復(fù)酶類和修復(fù)機(jī)制了解還不多，但DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞突變、壽命、衰老、腫瘤發(fā)生、輻射效應(yīng)、一些毒物作用都有親密關(guān)系。

人類遺傳性疾病已發(fā)覺4000各種，其中不少與DNA修復(fù)缺點(diǎn)相關(guān)，這些DNA修復(fù)缺點(diǎn)細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)輻射和致癌劑敏感性增加。核酸的生物合成ppt第52頁（四）細(xì)菌限制-修飾系統(tǒng)細(xì)菌體內(nèi)存在能識(shí)別外源DNA特定核苷酸序列、并切斷雙鏈DNA一個(gè)酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）。細(xì)菌和宿主細(xì)胞DNA不被水解原因：修飾甲基化酶（使特定堿基序列上產(chǎn)生種屬專一甲基化模式）、限制酶（水解斷裂任何一條特定序列、卻未甲基化DNA雙鏈）保護(hù)。核酸的生物合成ppt第53頁重組DNA技術(shù)（五）基因重組與DNA克隆核酸的生物合成ppt第54頁核酸的生物合成ppt第55頁基因之間以隨機(jī)或定向方式進(jìn)行重排稱為基因重組。DNA重組技術(shù)（基因工程、DNA克隆）：采取類似工程設(shè)計(jì)方法，人為地在體外將核酸分子插入質(zhì)粒、病毒或其它載體中，組成遺傳物質(zhì)新組合，并將它轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞中擴(kuò)增和表示。常見載體：質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒、YAC（酵母人工染色體）載體※

探針：能識(shí)別克隆DNADNA片段，即與克隆DNA互補(bǔ)放射性核酸片段?；蚩寺』A(chǔ)步驟:核酸的生物合成ppt第56頁核酸的生物合成ppt第57頁藍(lán)白斑篩選核酸的生物合成ppt第58頁基因載體目標(biāo)基因

質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫限制性內(nèi)切酶有切口載體有切口目標(biāo)基因DNA連接酶

重組體

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體宿主細(xì)胞

表型篩選電泳法核酸雜交免疫學(xué)方法目標(biāo)基因表示核酸的生物合成ppt第59頁基因克隆應(yīng)用:1、抗蟲轉(zhuǎn)基因植物※已問世轉(zhuǎn)基因抗蟲植物：

棉、玉米、馬鈴薯、番茄、大豆、蠶豆、煙草、蘋果、核桃、楊、菊花、和白花三葉草等?！糜跉⑾x基因主要有：

★Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、核酸的生物合成ppt第60頁

※已用于殺蟲基因主要有：

病毒外殼蛋白質(zhì)基因、病毒復(fù)制酶（這些基因轉(zhuǎn)化植物表現(xiàn)出對(duì)同種病毒或相近病毒或病毒RNA侵染高水平抗性

）

幾丁質(zhì)酶基因、抗毒素合成基因抗CMV甜椒2、抗病轉(zhuǎn)基因植物※

已問世轉(zhuǎn)基因抗病植物：

小麥、甜椒、番茄核酸的生物合成ppt第61頁

比如，將魚抗凍蛋白基因?qū)藷煵莺头?，使煙草和番茄耐寒能力都有提升。另外，將抗除草劑基因?qū)舜蠖?、玉米等作物，噴灑除草劑時(shí)，殺死田間雜草而不損傷作物。3、抗逆轉(zhuǎn)基因植物核酸的生物合成ppt第62頁※延長(zhǎng)果實(shí)儲(chǔ)備期

過程中需要乙烯形成酶。經(jīng)過基因工程能夠取得能抑制乙烯形成酶基因表示植物新品種，這些轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)既保持了原有品質(zhì)，又延長(zhǎng)了儲(chǔ)備期。4、利用轉(zhuǎn)基因改良植物品質(zhì)核酸的生物合成ppt第63頁5、用于提升動(dòng)物生長(zhǎng)速度轉(zhuǎn)基因鯉魚（上）和同齡鯉魚（下）核酸的生物合成ppt第64頁6、利用轉(zhuǎn)基因工程菌來生產(chǎn)細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素等核酸的生物合成ppt第65頁（六）PCR技術(shù)與DNA擴(kuò)增1、定義：

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一個(gè)模擬天然DNA復(fù)制過程，即在有DNA模板、TaqDNA聚合酶、RNA引物和四種dNTP情況下，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、中溫延伸,這么重復(fù)循環(huán)過程中，在體外擴(kuò)增特異性DNA片段分子生物學(xué)技術(shù)。核酸的生物合成ppt第66頁2、PCR基礎(chǔ)原理：

1)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L核酸的生物合成ppt第67頁變性

首次94℃,5min;以后每次94℃,30~60s復(fù)性延伸兩段引物45~65s每次72℃，

45s；最終一次72℃

，7minTaq聚合酶開始下一輪，共25~30個(gè)循環(huán)后，兩個(gè)引物之間特異DNA可擴(kuò)增106~109倍。2)PCR反應(yīng)過程核酸的生物合成ppt第68頁

①模板DNA變性：模板DNA經(jīng)加熱至9４℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，方便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新與模板DNA鏈互補(bǔ)半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可取得更多“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目標(biāo)基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。核酸的生物合成ppt第69頁3、PCR技術(shù)應(yīng)用：

基因克隆，基因工程，人遺傳病分類和診療，腫瘤發(fā)生，DNA測(cè)序，法醫(yī)學(xué)判定等領(lǐng)域。核酸的生物合成ppt第70頁核酸的生物合成ppt第71頁2）基因工程核酸的生物合成ppt第72頁P(yáng)CR-RFLP法：限制性內(nèi)切酶3)惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因核酸的生物合成ppt第73頁突變限制性內(nèi)切酶核酸的生物合成ppt第74頁正常突變電泳核酸的生物合成ppt第75頁4）基因判定女性男性Y引物PCR男性女性核酸的生物合成ppt第76頁二、RNA生物合成在RNA聚合酶催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA過程稱為轉(zhuǎn)錄。核酸的生物合成ppt第77頁□其它RNA：

snRNA：核內(nèi)小分子RNA，mRNA加工剪接和成熟。

snoRNA:核仁小分子RNA，rRNA切割和修飾。

asRNA:反義RNA，抑制RNA加工與翻譯，是原核基因表

達(dá)一個(gè)主要調(diào)控方式。

dsRNA:雙鏈RNA，可誘發(fā)與該RNA高度同源基因序列

特異性“緘默”。

siRNA：小分子干擾RNA，由細(xì)胞中較長(zhǎng)外源雙鏈RNA

（30個(gè)核苷酸以上）降解而成，特異地降解目標(biāo)

mRNA。（介導(dǎo)RNAi技術(shù)，即RNA干涉技術(shù)）

miRNA:微RNA,內(nèi)源性(細(xì)胞發(fā)育過程中產(chǎn)生),降解mRNA.●

經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成RNA有各種，主要有rRNA，tRNA，mRNA。核酸的生物合成ppt第78頁（一）RNA轉(zhuǎn)錄合成

1.特點(diǎn)（1）轉(zhuǎn)錄不對(duì)稱性轉(zhuǎn)錄(transcription)不對(duì)稱性就是指以雙鏈DNA中一條鏈作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而將遺傳信息由DNA傳遞給RNA。核酸的生物合成ppt第79頁對(duì)于不一樣基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息能夠存在于兩條不一樣DNA鏈上。能夠轉(zhuǎn)錄RNA那條DNA鏈稱為模板鏈（反義鏈），而與之互補(bǔ)另一條DNA鏈稱為編碼鏈（有義鏈）。模板鏈編碼鏈5’5’3’3’5’5’核酸的生物合成ppt第80頁（2）轉(zhuǎn)錄單向性、連續(xù)性RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能向一個(gè)方向進(jìn)行聚合，所依賴模板DNA鏈方向?yàn)?'→5'，而RNA鏈合成方向?yàn)?'→3'。

轉(zhuǎn)錄時(shí)，以DNA為模板，在RNA聚合酶催化下，連續(xù)合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進(jìn)行連接。核酸的生物合成ppt第81頁（3）有特定起始和終止位點(diǎn)RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能以DNA分子中某一段作為模板，故存在特定起始位點(diǎn)和特定終止位點(diǎn)。特定起始點(diǎn)和終止點(diǎn)之間DNA鏈組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，通常由轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)調(diào)整次序組成。

核酸的生物合成ppt第82頁2.RNA轉(zhuǎn)錄合成條件

除了需要底物（ATP、GTP、CTP、UTP）、模板（DNA鏈）外，RNA合成還需要：（1）RNA聚合酶依賴于DNARNA聚合酶（不一樣于DNA復(fù)制時(shí)引物酶）在DNA模板和四種核糖核苷酸存在條件下，不需要引物，即可從5'→3'聚合RNA。

核酸的生物合成ppt第83頁原核生物中RNA聚合酶全酶由五個(gè)亞基組成，即α2ββ'ωσ。σ亞基與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)識(shí)別相關(guān)，而在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放，余下個(gè)別（α2ββ'ω）被稱為關(guān)鍵酶，與RNA鏈聚合相關(guān)。

核酸的生物合成ppt第84頁真核生物RNA聚合酶

酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對(duì)活性對(duì)α-鵝膏蕈堿敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA（5.8SrRNA18SrRNA28SrRNA）50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)

mRNA、snRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)tRNA5SrRNAU6snRNA約10%存在物種特異性核酸的生物合成ppt第85頁（2）終止因子ρ蛋白：是一個(gè)六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量為50kd。該蛋白因子能識(shí)別終止信號(hào)，并能與RNA緊密結(jié)合，造成RNA釋放。核酸的生物合成ppt第86頁3.RNA轉(zhuǎn)錄合成過程

（1）識(shí)別

原核生物RNA聚合酶中σ因子識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，并與關(guān)鍵酶結(jié)合形成全酶復(fù)合物。開啟子(promoter)：指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開啟基因轉(zhuǎn)錄一段DNA序列。核酸的生物合成ppt第87頁●

原核生物開啟子結(jié)構(gòu)1975，Pribnow足跡法（footprint）確定開啟子序列核酸的生物合成ppt第88頁

大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識(shí)別開啟子區(qū)-35區(qū)：T85T83G81A61C69A52-10區(qū)：T89A89T50A65A50T96核酸的生物合成ppt第89頁●經(jīng)典原核生物開啟子結(jié)構(gòu)

-35-10轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)TTGACA

16-19bp

TATAAT5-9bp-35區(qū)～-10區(qū)間隔+1核酸的生物合成ppt第90頁

①TATA區(qū)：酶緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開，并決定轉(zhuǎn)錄起始位置）。（-10區(qū),Pribnow區(qū)）

②TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識(shí)別信號(hào)。（-35區(qū)，與RNA聚合酶全酶結(jié)合相關(guān)，以及與開啟子強(qiáng)弱活性相關(guān)。）※

細(xì)菌開啟子主要保守序列核酸的生物合成ppt第91頁●真核生物開啟子□真核有三種不一樣開啟子和相關(guān)元件□開啟子Ⅱ最為復(fù)雜，它和原核開啟子有很多不一樣核酸的生物合成ppt第92頁□真核生物開啟子結(jié)構(gòu)

◆關(guān)鍵開啟子（corepromoter）◆上游開啟子元件（upstreampromoterelement，UPE）核酸的生物合成ppt第93頁●

關(guān)鍵開啟子定義：指確保RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需、最少DNA序列，包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游TATA區(qū)。（Hogness區(qū)）作用：選擇正確轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，確保準(zhǔn)確起始。（DNA雙鏈開始解開）TATA常在-25bp左右，相當(dāng)于原核-10序列T85A97T93A85A63A83A50核酸的生物合成ppt第94頁（2）起始RNA聚合酶全酶促使局部雙鏈解開，并催化ATP或GTP與另外一個(gè)三磷酸核苷聚合，形成第一個(gè)3’,5’-磷酸二酯鍵。（3）延長(zhǎng)σ因子從全酶上脫離，余下關(guān)鍵酶繼續(xù)沿DNA鏈移動(dòng)，按照堿基互補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)，不停聚合RNA。

核酸的生物合成ppt第95頁●強(qiáng)終止子－－不依賴因子終止

①終止位點(diǎn)上游普通存在一個(gè)富含GC堿基二重對(duì)稱區(qū)，RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

②在終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成序列，RNA3’端為寡聚U。（4）終止核酸的生物合成ppt第96頁發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。核酸的生物合成ppt第97頁終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U長(zhǎng)短相關(guān)，長(zhǎng)度效率核酸的生物合成ppt第98頁●弱終止子－－依賴因子終止因子：六聚體蛋白、水解各種核苷三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。核酸的生物合成pp