基因工程第二章載體第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質粒載體（plasmidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一質粒載體的生物學特征（1）質粒是一種廣泛存在于細菌細胞中染色體以外的能自主的復制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現了質粒，目前對細菌的質粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質粒。（2）質粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質分子，最大的達到200kb。質粒的拷貝數多則50，少則只有一個。第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（3）質粒的不親和性，兩種親緣關系密切的不同質粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存，屬于同一個不親和群，如pMB1或ColE1的派生質粒。已鑒別出25個以上大腸桿菌質粒的不親和群，它們是不相容群體的。（4）質粒的分類F質粒，或叫致育質粒，僅攜帶轉移基因，特征：促進質粒間的有性結合。R質粒，或叫耐藥性質粒，能賦予宿主細胞耐藥性，特征：耐藥性。Ti質粒,根瘤農桿菌中的毒性質粒，賦予宿主細胞致病性。

Col質粒，降解質粒，質粒載體的生物學特征第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（5）質粒的存在形式

有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構型的同一種質粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移率。其中走在最前面的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋SC構型）開環(huán)雙螺旋（一個裂口，OC構型）線狀雙螺旋（兩個裂口，L構型）質粒載體的生物學特征第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（1）pUC是在pBR322基礎上發(fā)展起來的克隆載體。大小為2.7kb，帶有復制起始位點，ampicillin抗性基因和lacZ

基因。常用質粒載體介紹第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（2）pGEM-3Z

帶有

LacZ

基因，大小為2.9kb，氨芐青霉素抗性基因，高拷貝。第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（3）pBluescriptSK

pBluescriptSK同pGEM類似，另外還帶有線狀噬菌體f1的復制起始位點。

可以產生單鏈DNA。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二章基因克隆的載體引言（introduction）第一節(jié)質粒載體（plasimidvectors）第二節(jié)噬菌體載體（phagevectors）第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)噬菌體載體一、噬菌體

1噬菌體的生物學特征

2噬菌體的侵染3噬菌體的DNA分子二、M13噬菌體第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體的生物學特性

噬菌體由正二十面體的蛋白質頭部和中空管狀的蛋白質尾部組成。頭部包含線狀染色體DNA，侵染寄主時將自己的DNA注入寄主細菌。噬菌體屬溫和噬菌體。第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的生物學特性

ThePhage

consistofalinearchromosomeenclosedinaproteincoat(capsid,衣殼).Whenthephageinfectingthehostcells,itinjectsitsDNAintothehostbacterium.第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體的侵染噬菌體的侵染是溶源侵染，是噬菌體DNA分子在宿主細胞中能夠穩(wěn)定存在，許多噬菌體DNA能整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復制。在溶源性細菌內存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體（prophage

）。而攜帶了原噬菌體的細菌被稱為溶源菌（lysogen）

。第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

噬菌體的侵染第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的侵染過程Lysogeniccycle

(溶源周期)：Undercertaincircumstances,however,thelambdaDNAinsertsitselfintotheE.colichromosomeandisastablepartofthechromosome.TheLambdaDNAisreplicatedalongWith

theE.colichromosome.Ifthehostcellbecomesdamaged,suchasUVtreatment,theprophageDNAexcisesitselfandundergoeslyticgrowth.第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的DNA分子DNA的分子為49kb,大多數基因已經測序和定位。至少包括61個基因，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分（b2區(qū)）可以被外源基因取代而不會影響到噬菌體的正常功能。第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一噬菌體的DNA分子

DNA在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當其注入到寄主細胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點（cohesiveendsite）.另外的作用是內切核酸酶的識別序列。

第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)噬菌體載體一、噬菌體二、M13噬菌體

1M13噬菌體的生物學特征

2M13噬菌體的侵染3M13噬菌體的載體第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一1.M13噬菌體的生物學特性

M13是線狀的大腸桿菌噬菌體，顆粒內含有6047bp的閉合環(huán)狀單鏈DNA基因組，相對小，意味著可供插入的外源DNA的空間小。M13單鏈DNA的復制型（RF，replicativeform）是呈雙鏈環(huán)形，此時的DNA，不會插入細菌基因組，持續(xù)復制，當積累到100-200個拷貝后，噬菌體DNA編碼的正鏈特異結合蛋白很快就阻止了負鏈的進一步生成，但以負鏈為模板的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒。第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一M13噬菌體的侵染第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一作為載體的優(yōu)勢1基因組小于10kb,適合載體的要求。2復制時其雙鏈形式，可以像對質粒一樣處理。3容易培養(yǎng)或轉染，容易獲得基因組。4突出優(yōu)點在于可以提供單鏈DNA，這在DNA測序和體外突變中作用明顯。4在M13基因組中有一段507bp的基因間隔區(qū)，該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于載體的