干細胞工程專題知識干細胞工程專題知識第1頁干細胞（stemcell）:是含有自我更新、高度增殖和多項分化潛能細胞群體，是動物有機體和各種組織器官起源細胞．什么是干細胞?干細胞工程專題知識第2頁骨髓干細胞干細胞工程專題知識第3頁神經(jīng)干細胞干細胞工程專題知識第4頁

干細胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景生命學(xué)科研究領(lǐng)域，1999年干細胞研究被美國《科學(xué)》雜志評為1999年度世界十大科學(xué)之冠，年干細胞研究再次被《科學(xué)》雜志評為該年度世界十大科學(xué)成就之一。

組織工程是以干細胞研究為基礎(chǔ)發(fā)展起來，它有望處理臨床上急需人工組織與器官問題，進展極為快速，已經(jīng)成為干細胞應(yīng)用主要方向。干細胞工程專題知識第5頁干細胞有幾個主要特征

干細胞本身不是終末分化細胞干細胞能無限增殖分裂干細胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)干細胞分裂產(chǎn)生子細胞只能有兩種命運—保持干細胞或分化為特定細胞干細胞工程專題知識第6頁干細胞分類１按分化潛能大小來分類:全能干細胞(Totipotentstemcell

):它含有形成完整個體

分化潛能。如受精卵，胚胎干細胞多能干細胞(pluripotentstemcell

):含有分化出各種組織細胞潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體能力，發(fā)育潛能受到一定限制。如骨髓多能造血干細胞是經(jīng)典例子，它可分化出最少十二種血細胞干細胞工程專題知識第7頁專能干細胞(multipotentstemcell):這類干細胞只能向一個類型或親密相關(guān)兩種類型細胞分化，如上皮組織基底層干細胞、肌肉中成肌細胞等干細胞工程專題知識第8頁２依據(jù)起源來分:

起源于胚胎---胚胎干細胞ESC

（EmbryonicStemCell）

胚胎生殖細胞EGC

（EmbryonicGermCell）起源于成體---成體組織起源干細胞ASC

（Adult-derivedStemCell）干細胞工程專題知識第9頁３依據(jù)干細胞組織發(fā)生名稱進行分類:胎胎干細胞造血干細胞骨髓間質(zhì)干細胞肌肉干細胞成骨干細胞內(nèi)胚層干細胞視網(wǎng)膜干細胞胰腺干細胞干細胞工程專題知識第10頁干細胞轉(zhuǎn)分化和去分化

1．干細胞轉(zhuǎn)分化：一個組織類型干細胞在適當(dāng)條件下分化為另一個組織類型細胞過程稱干細胞轉(zhuǎn)分化。干細胞工程專題知識第11頁試驗：C57BL/6J♂成年小鼠造血干細胞WBB6F/J-KitW/KitW-V♀鼠(亞致死劑量同位素照射)

在♀鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞中檢測到Y(jié)染色體.即♂鼠造血干細胞移植到♀鼠中分化為腦星形膠質(zhì)細胞。移植分離3天干細胞工程專題知識第12頁2．干細胞去分化：一個干細胞向其前體細胞逆向轉(zhuǎn)化稱干細胞去分化。試驗：成體鼠造血干細胞鼠卵泡內(nèi)細胞團表示胎鼠珠蛋白基因→參加胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育。注入分化狀態(tài)逆轉(zhuǎn)干細胞工程專題知識第13頁3.干細胞可塑性(1)干細胞橫向分化：在干細胞移植時，供體干細胞在受體中通常分化為與其組織起源一致細胞。但有時供體干細胞會分化出與其組織起源不一致其它細胞，這種現(xiàn)象稱干細胞橫向分化(trans-differentiation)。干細胞工程專題知識第14頁干細胞橫向分化表明成體干細胞被移植入受體中含有很強可塑性。為干細胞治療提供了可能。(2)試驗：小鼠肌肉干細胞→體外培養(yǎng)5天＋少許骨髓間質(zhì)細胞接收致死量輻射小鼠中各種血細胞系。植入分化干細胞工程專題知識第15頁

胚胎干細胞當(dāng)受精卵分裂發(fā)育成囊胚時，內(nèi)層細胞團細胞即為胚胎干細胞。深入說，胚胎干細胞（ES細胞）是一個高度未分化細胞。它含有發(fā)育全能性，能分化出成體動物全部組織和器官，包含生殖細胞。ES細胞研究可追溯到上世紀五十年代，因為畸胎瘤干細胞（EC細胞）發(fā)覺開始了ES細胞生物學(xué)研究歷程。干細胞工程專題知識第16頁胚胎干細胞

1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分離得到鼠胚胎干細胞。至今已分離得到胚胎干細胞物種有：金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）分離得到人胚胎干細胞（1998）分離得到人胚胎生殖細胞（1998）干細胞工程專題知識第17頁人多能(pluripotent)干細胞：JamesA.Thomson在Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)一個研究小組從人胚胎組織中培養(yǎng)出了干細胞株。方法：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊胚階段，提取innercellmass細胞，建立細胞株。經(jīng)測試這些細胞株細胞表面marker和酶活性，證實它們就是胚胎干細胞。用這種方法，每個胚胎可取得15－20個細胞用于培養(yǎng)。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)另一個研究小組也從人胚胎組織中建立了干細胞株。方法是：從受精后5－9周人工流產(chǎn)胚胎中提取生殖母細胞(primordialgermcell)。由此培養(yǎng)細胞株，證實含有全能干細胞特征。

干細胞工程專題知識第18頁人胚胎干細胞取得(一)取得路徑：從早期胚胎取得2.從原始生殖細胞取得3.從移植細胞(克隆細胞)取得干細胞工程專題知識第19頁1．從早期胚胎取得美國Thompson研究小組是從囊胚期胚胎內(nèi)細胞團中取得胚胎干細胞：體外受精卵囊胚期去除滋養(yǎng)層→內(nèi)細胞團得5株干細胞系

32代(8個月)保持未分化狀態(tài)。

傳代培養(yǎng)發(fā)育免疫切除法干細胞工程專題知識第20頁2．從原始生殖細胞取得gearhart小組：流產(chǎn)胎兒性腺嵴原始生殖細胞取得5個多能干細胞系7個月不分化。思緒：原始生殖細胞是未分化細胞。培養(yǎng)

分離培養(yǎng)干細胞工程專題知識第21頁3．體細胞移植分化細胞核(乳腺、皮膚細胞)

去核卵細胞→雜合細胞發(fā)育成囊胚胚胎干細胞成體(如多利羊)。

分離發(fā)育

移植

刺激干細胞工程專題知識第22頁干細胞體外培養(yǎng)因為干細胞數(shù)目少，應(yīng)用時需先在體外進行非分化性增殖，再進行誘導(dǎo)分化。不一樣組織起源干細胞培養(yǎng)條件不盡相同。干細胞工程專題知識第23頁1·

培養(yǎng)條件：需要許多生長因子和間質(zhì)細胞共培養(yǎng)。如Brustle等在體外培養(yǎng)了鼠ES細胞。分離ES細胞培養(yǎng)培養(yǎng)生長增殖保持分化潛能。停頓供給生長因子，ES細胞分化為寡樹突細胞或星狀細胞。EGF培養(yǎng)基FGF2+PDGFFGF2培養(yǎng)基干細胞工程專題知識第24頁2·

分化誘導(dǎo)在應(yīng)用前還需依據(jù)靶組織類型對培養(yǎng)干細胞進行定向分化誘導(dǎo)。分化誘導(dǎo)需了解：①干細胞發(fā)育相關(guān)信號調(diào)整；②干細胞發(fā)育微環(huán)境。干細胞工程專題知識第25頁胚胎干細胞分化潛能

胚胎干細胞是全能(多能)性干細胞，含有分化為各種組織細胞潛能。干細胞工程專題知識第26頁試驗1：移植試驗人胚胎干細胞小鼠體內(nèi)畸胎瘤(良性)→有三個胚層產(chǎn)生組織：移植發(fā)育胃上皮(內(nèi)胚層)骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌等(中胚層)神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)復(fù)層磷狀上皮等(外胚層)干細胞工程專題知識第27頁ES細胞體外定向誘導(dǎo)分化原理：選擇適當(dāng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)模式，經(jīng)過誘導(dǎo)物與細胞表面受體結(jié)合或使細胞發(fā)生輕度可逆性損傷等，使被誘導(dǎo)細胞按預(yù)定細胞類型方向分化。干細胞工程專題知識第28頁ES細胞體外定向誘導(dǎo)分化方法：經(jīng)懸浮培養(yǎng)或懸滴培養(yǎng)，使ES細胞形成

EB(類胚體)，再將EB消化成單細胞貼壁培養(yǎng)，并于不一樣培養(yǎng)階段添加不一樣種類和不一樣濃度化學(xué)物質(zhì)、條件培養(yǎng)液或細胞因子等，直接促進ES細胞定向分化為某種特殊類型細胞，或培養(yǎng)條件對一些類型細胞分化起抑制作用，從而高效誘導(dǎo)目標細胞分化。

干細胞工程專題知識第29頁分化誘導(dǎo)原因:化學(xué)誘導(dǎo)物(視黃酸、DMSO等）細胞因子（骨形成蛋白、視經(jīng)生長因子等）轉(zhuǎn)錄因子(Oct-4等）干細胞工程專題知識第30頁誘導(dǎo)分化方法:單層ES細胞誘導(dǎo)分化EB培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化干細胞工程專題知識第31頁干細胞工程專題知識第32頁干細胞工程專題知識第33頁干細胞工程專題知識第34頁

ES細胞生物學(xué)特征

1.各種動物ES細胞含有與早期胚胎細胞相同形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。

2.ES細胞與卵圓柱期（eggcylinderstage）胚胎外胚層和胎兒生殖峙原始生殖細胞類似，而與ICM細胞有差異。

3.細胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了整倍體性質(zhì)。正常ES細胞染色體正常，如發(fā)生異常則其極難發(fā)育分化形成動物個體。

干細胞工程專題知識第35頁4.ES細胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化扁平狀上皮細胞。5.ES細胞增殖快速，每18－24h分裂增殖1次。6.另外，其還能夠在體外進行選擇、操作、凍存。凍存細胞可在需要時隨時解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特征，而且來自一個克隆細胞含有一樣特征。干細胞工程專題知識第36頁ES細胞生物學(xué)特征細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型細胞高度分化潛能堿性磷酸酶表示胚胎階段特異性細胞表面抗原表示干細胞工程專題知識第37頁形態(tài)和生化特征

1.形態(tài)：細胞體積小，核大，1~多個核仁。離體培養(yǎng)可產(chǎn)生密集多細胞克隆。2.生化特征：端粒酶活性高。3.干細胞物理特征：如干細胞對Hoechst33324和Rhodamine123染料不著色。干細胞工程專題知識第38頁4.

干細胞表面免疫原性：普通表示胚胎早期表面抗原，而且有種屬差異。如小鼠胚胎干細胞表示胚胎階段性特異抗原-1(SSEA-1)，不表示SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干細胞表示SSEA-3或SSEA-4。干細胞工程專題知識第39頁ES細胞高度分化潛能

ES細胞全能性是其區(qū)分于成纖維細胞等體細胞顯著特點：ES細胞在體外需在喂養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)才能維持其未分化狀態(tài)，一旦脫離喂養(yǎng)層就自發(fā)地進行分化。2.在單層培養(yǎng)時細胞自發(fā)分化成各種細胞，懸浮培養(yǎng)中：“簡單類胚體”

“囊狀胚體”

細胞分化物。干細胞工程專題知識第40頁3.ES細胞可進行誘導(dǎo)分化*用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90％以上ES細胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，*聚集培養(yǎng)ES細胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮心肌細胞。*將ES細胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細胞組成可代表3個胚層細胞。*用ES細胞作核供體進行細胞核移植，能夠得到可發(fā)育重構(gòu)胚和動物個體。干細胞工程專題知識第41頁

堿性磷酸酶表示

許多資料表明，小鼠、大鼠桑椹胚細胞和囊胚細胞都有堿性磷酸酶（AKP）表示，小鼠EC細胞和ES細胞中均含有豐富AKP。而在已分化EC細胞和ES細胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。所以，AKP常見來作為判定EC細胞或ES細胞分化是否標志之一。干細胞工程專題知識第42頁胚胎階段特異性細胞表面抗原表示

早期胚胎細胞表面均表示胚胎階段特異性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎原始外胚層細胞、ES細胞、EC細胞和原始生殖細胞表面均可檢測到SSEA－1表示。小鼠SSEA－1表示自8一細胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細胞全部呈強陽性，晚期囊胚中個別ICM呈強陽性，個別呈弱陽性，少個別為陰性。所以，SSEA也常作為ES細胞判定一個標志。干細胞工程專題知識第43頁胚胎干細胞判定--細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)--核型分析--堿性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫熒光標識--分化能力檢測體外分化試驗體內(nèi)分化試驗嵌合體形成試驗核移植試驗干細胞工程專題知識第44頁ES細胞形態(tài)學(xué)判定

依ES細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個或幾個核仁）和生長特征（呈克隆狀生長，細胞緊密聚集，形似鳥巢，界限不清）對ES細胞進行初步判定。干細胞工程專題知識第45頁核型分析

ES細胞含有正常二倍體核型，在體外培養(yǎng)條件下，穩(wěn)定細胞系細胞染色體數(shù)目和核型保持與起源動物品系一致，可用核型分析進行檢驗。干細胞工程專題知識第46頁

堿性磷酸酶（AKP）染色

*常見快綠（FastGreenStaining)染色法，對照以已建系ES細胞（或小鼠脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽性對照，作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對照。

*結(jié)果判定陽性對照ES細胞染成棕色，陰性對照無色。小鼠3．5日齡胚胎ICM為強陽性。

干細胞工程專題知識第47頁SSEA-I免疫熒光標識

第1抗體，SSEA－1（鼠抗ES細胞單克隆抗體），1:100稀釋；第2抗體，羊抗鼠1：10稀釋;封閉液，羊抗兔lgG。步驟：①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20min；②再以杜氏PBS洗3次,封閉液中置20min；③以杜氏PBS洗3次，加第1抗體于4℃過液；④以杜氏PBS洗3次，加第2抗體于30℃溫箱置30min；⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。樣本在激光共聚焦圖像系統(tǒng)下觀察,結(jié)果依細胞是否出現(xiàn)熒光作出判斷。干細胞工程專題知識第48頁

分化能力檢測體外分化試驗體內(nèi)分化試驗嵌合體形成核移植干細胞工程專題知識第49頁

胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES細胞）也可被稱為多能干細胞（pluripotentstemcell，PSC），是胚胎或原始生殖細胞經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)后篩選出含有發(fā)育全能性細胞。其能夠定向誘導(dǎo)分化為幾乎全部種類細胞，甚至形成復(fù)雜組織和器官，其建系、體外擴增、定向誘導(dǎo)分化、調(diào)控機制、細胞性能、組織重構(gòu)等方面研究將在未來人體發(fā)育、基因功效、藥品開發(fā)、細胞治療和組織器官替換治療中發(fā)揮主要作用，并成為組織器官移植新資源。當(dāng)前胚胎干細胞研究與應(yīng)用干細胞工程專題知識第50頁51源于胚胎干細胞細胞已能或可能治療許多疾病神經(jīng)細胞心肌細胞B型胰島細胞軟骨細胞白細胞皮膚細胞肝細胞骨細胞視細胞骨骼肌細胞帕金森病心肌梗死糖尿病骨關(guān)節(jié)炎白血病燒傷和創(chuàng)傷肝炎骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)膜退化肌營養(yǎng)不良治療干細胞工程專題知識第51頁ES研究面臨難題（1）體外培養(yǎng)ES細胞應(yīng)該是既能快速無限增殖，又呈未分化狀態(tài)。怎樣平衡這一對矛盾,必須篩選適宜培養(yǎng)條件。當(dāng)前在ES細胞研究中存在著建系成功率也不高等問題,只在小鼠中建立了穩(wěn)定ES細胞系，家畜、人類細胞系建立最正確條件仍無定論。干細胞工程專題知識第52頁（2）ES細胞高度未分化,含有形成畸胎瘤可能性,所以在使用ES細胞進行治療前必須首先體外誘導(dǎo)ES細胞分化產(chǎn)生某種特異組織細胞或設(shè)計自殺基因,當(dāng)移植細胞向腫瘤發(fā)展時,自殺基因能開啟自毀機制使其凋亡。但怎樣誘導(dǎo)ES細胞定向分化成單一類型分化細胞,是至今仍未處理難題。所以，必須尋找各種細胞定向誘導(dǎo)分化條件和方法，以及不一樣干細胞表面標志和分選技術(shù)，從而得到所需要細胞或組織。干細胞工程專題知識第53頁（3）ES細胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上突破，因為器官形成是一個非常復(fù)雜三維過程,很多器官是兩個不一樣胚層組織相互作用而形成。即便是發(fā)育完整來自自然機體器官,要離體培養(yǎng)并維持其正常生理功效當(dāng)前還無法做到,器官體外保留和維持仍是器官移植中難題。干細胞工程專題知識第54頁（4）最大障礙來自于倫理學(xué)問題，尤其是ES細胞應(yīng)用受到倫理、法律、宗教以及社會原因強烈反對，有些國家甚至明令禁止進行人類ES細胞研究。不論從基礎(chǔ)研究角度來講還是從臨床應(yīng)用方面來看，人類ES細胞帶給人類益處遠遠大于在倫理方面可能造成負面影響，但伴隨觀念改變，大家會逐步認識到ES細胞對臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)理論研究主要作用。

干細胞工程專題知識第55頁胚胎干細胞研究倫理挑戰(zhàn)

胚胎干細胞研究在倫理、道德和宗教方面碰到很大障礙。避孕、流產(chǎn)和體外授精在西方國家引發(fā)很大爭議。干細胞工程專題知識第56頁(一)存在問題

1.

胚胎干細胞起源是否符正當(dāng)律與道德？2.胚胎干細胞應(yīng)用是否會引發(fā)倫理及法律問題？3.該項研究是否會造成人流泛濫？或造成醫(yī)生刻意造成胚胎流產(chǎn)？4.怎樣對待克隆人研究？干細胞工程專題知識第57頁（二）反對人觀點

1.認為胚胎干細胞研究破壞人類生命，其觀念基于人類生命起始于早期胚胎。2.天主教派極力反對胚胎干細胞研究，認為用人類胚胎干細胞進行研究是一個“邪惡”。干細胞工程專題知識第58頁(三)支持者觀點

科學(xué)界和病人組織強烈呼吁政府支持這項研究。年4月，James

Watson博士(DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)創(chuàng)造人、冷泉港試驗室主任)提倡發(fā)起了由80位諾貝爾獎取得者參加署名運動，呼吁政府支持干細胞研究。干細胞工程專題知識第59頁(四)西方政府態(tài)度

1．美國總統(tǒng)布什(1)當(dāng)選總統(tǒng)前反對，當(dāng)選后出于政治目標，同意政府有限支持。年8月9日，布什作出決定，美國政府資助對年8月9日前得到人體胚胎干細胞研究，但不支持從新胚胎中獲取干細胞研究。干細胞工程專題知識第60頁(2)同時，布什提出成立一個由科學(xué)家、醫(yī)生、倫理學(xué)家、律師、神學(xué)家等組成總統(tǒng)生物倫理教授委員會，指導(dǎo)干細胞研究和管理。由芝加哥大學(xué)生物倫理學(xué)教授LeonKass擔(dān)任主席。干細胞工程專題知識第61頁(3)依據(jù)布什決定，NIH對現(xiàn)存人體胚胎干細胞系進行登記，認定世界上有64個人體胚胎干細胞系符合聯(lián)邦政府資助標準。(4)64個人體胚胎干細胞系分布在6個國家10個機構(gòu)中：瑞典24個，美國20個，印度10個，澳大利亞6個，以色列4個。NIH試圖用這些人體胚胎干細胞系完成相關(guān)人體胚胎干細胞基礎(chǔ)研究工作。干細胞工程專題知識第62頁3．其它國家態(tài)度(1)德國禁止利用人體胚胎干細胞進行研究。(2)澳大利亞開始仿效美國作法，有限支持人體胚胎干細胞研究。(3)法國、英國、日本允許利用多出胚胎和SCNT技術(shù)創(chuàng)造胚胎進行干細胞研究。干細胞工程專題知識第63頁成體干細胞是存在于成體動物許多組織和器官，含有修復(fù)和再生能力細胞。成體干細胞大多數(shù)時候處于靜息狀態(tài)。在特定條件下，成體干細胞或者產(chǎn)生新干細胞，或者按一定程序分化，形成新功效細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退動態(tài)平衡。成體干細胞（adultstemcell，ASC）

干細胞工程專題知識第64頁65干細胞工程專題知識第65頁成體干細胞優(yōu)點成體干細胞則可從患者本身取得，不存在組織相容性問題。成體干細胞不會誘發(fā)畸胎瘤發(fā)生。成體干細胞也不存在倫理學(xué)爭吵。干細胞工程專題知識第66頁成體干細胞不足還未從人體全部組織中分離出成體干細胞.成體干細胞含量極微，極難分離和純化，且數(shù)量隨年紀增加而降低在一些遺傳缺點疾病中，遺傳錯誤很可能也會出現(xiàn)于病人干細胞中，這么干細胞不適于移植成人身上取得干細胞可能沒有年輕人干細胞那樣增殖能力因為日常生活中人是暴露在各種環(huán)境之下，日光和毒素等都有可能造成基因突變，成體干細胞可能包含更多DNA異常等。干細胞工程專題知識第67頁68胚胎干細胞和成體干細胞比較胚胎干細胞成體干細胞①來自胚泡內(nèi)細胞群起源于骨髓、外周血、角膜、視網(wǎng)膜、腦、骨骼肌、齒髓、肝、皮膚、胃腸道粘膜層和胰腺等②發(fā)育全能性，可誘導(dǎo)分化為機體分化較局限，個別成體干細胞（造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞）有一定跨系、跨胚層“可塑性”③無限自我更新能力病理條件下才顯出一定自我更新潛能④增殖能力強，便于應(yīng)用增殖能力較弱，故不能完全取代胚胎干細胞⑤細胞可不停增殖，“永生化”，移植后有形成腫瘤可能性成瘤可能性很?、薏荒茏泽w移植自體移植可防止免疫排斥⑦有倫理問題分離和使用不存在倫理問題干細胞工程專題知識第68頁成體干細胞建系細胞系(cellline):指從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來一群不均一細胞，能夠長久連續(xù)傳代建系方法:將外源性端粒酶催化亞基基因，經(jīng)過不一樣方法導(dǎo)入成體干細胞，使其整合到基因組中并正常表示，從而維持或重建干細胞端粒酶活性，建立起成體干細胞系干細胞工程專題知識第69頁成體干細胞可塑性

通常情況下，供體干細胞在受體中分化為與其組織起源一致細胞。而在一些情況下干細胞分化并不遵照這種規(guī)律。1999年Goodell等人分離出小鼠肌肉干細胞，體外培養(yǎng)5天后，與少許骨髓間質(zhì)細胞一起移植入接收致死量輻射小鼠中，結(jié)果發(fā)覺肌肉干細胞會分化為各種血細胞系。這種現(xiàn)象被稱為干細胞橫向分化

干細胞工程專題知識第70頁71間胚層組織類型干細胞轉(zhuǎn)分化為同胚層另一組織類型細胞間胚層組織類型干細胞轉(zhuǎn)分化為內(nèi)胚層組織類型細胞間胚層組織類型干細胞轉(zhuǎn)分化為外胚層組織類型細胞由此認為，成體干細胞有較大可塑性血細胞肌細胞血細胞肝細胞血細胞腦細胞干細胞工程專題知識第71頁72研究還表明，骨髓起源干細胞在特定環(huán)境中可向肝臟、胰腺、肌肉及神經(jīng)細胞分化；肌肉、神經(jīng)干細胞也可向造血細胞分化。造血干細胞（hematopoieticstemcell,HSC）既可分化為成熟造血細胞，也可分化為成熟皮膚表皮細胞、肺和胃腸道細胞干細胞工程專題知識第72頁73證實或推斷：在成體組織中依然殘留胚胎發(fā)育過程中各胚層定向和組織定向各類干細胞。在胚胎發(fā)育各個階段，有少個別干細胞中止參加胚胎發(fā)育，并轉(zhuǎn)入G0期。這些細胞既不增殖又不分化，依然保持干細胞基礎(chǔ)特征。出生后隨年紀增加，體內(nèi)組織中保留各類成體干細胞基礎(chǔ)特征不變。不過，在體外一定細胞因子誘導(dǎo)刺激下，它能夠從G0靜止期轉(zhuǎn)入細胞周期而增殖，并分化為某種組織定向細胞。

干細胞工程專題知識第73頁74組織干細胞分化可塑性是很有限，它只能沿著本組織各支系縱向分化（如造血干細胞多向分化，僅限于髓系和淋巴系造血細胞各支系縱向分化），不能跨越本組織定向限制，更不能突破胚層界限。在生物界或人類醫(yī)學(xué)史上也從未出現(xiàn)過因橫向分化所至疾病或怪胎。

干細胞工程專題知識第74頁75跨胚層轉(zhuǎn)分化可能原因是：骨髓中成體干細胞不但包含造血干細胞，間質(zhì)干細胞，而且還有其它各胚層起源干細胞及其分化后代，即各類非造血組織干細胞，如神經(jīng)干細胞、肝臟干細胞等。所謂成體干細胞多向分化可塑性，其實是胚胎發(fā)育期存留于造血組織等部位各胚層干細胞自然屬性，如肌肉勻漿中不但含有肌細胞，脂肪組織中不但含有脂肪細胞，其中還有各種成體干細胞，它們分化過程并沒有跨越組織定向限制。干細胞工程專題知識第75頁76

成體干細胞應(yīng)用1999年，Science雜志編者Bloom：“干細胞給人類提供了極大可能性：用干細胞修復(fù)病損臟器和細胞缺損”，他還說“最終可能用干細胞制成像腎、肝這么復(fù)雜器官”。干細胞工程專題知識第76頁77成體干細胞中，造血干細胞（包含骨髓、臍血和外周血中干細胞）已用于治療重度白血病和一些遺傳性血液病。

干細胞工程專題知識第77頁78①可經(jīng)誘導(dǎo)向軟骨細胞分化，并能分泌特異性Ⅱ型膠原基質(zhì)，所以可望成為工程化軟骨種子細胞；②分化為肌細胞，可能成為肌萎縮、肌營養(yǎng)不良時促進肌組織再生靶細胞；

骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcell,MSC）：干細胞工程專題知識第78頁79③與基因治療結(jié)合，可強化治療效果，對一些基因突變所致遺傳性疾?。虎芸煞蛛x其自體間充質(zhì)干細胞，體外進行改造，敲除突變基因，導(dǎo)入正常基因，然后重新輸入體內(nèi)，既糾正了遺傳缺點，又防止發(fā)生移植反應(yīng)。

干細胞工程專題知識第79頁80梗死心臟注入富含鼠骨髓干細胞后，40%心肌層得到恢復(fù)。

——Olic.Nature.,410:701-705用人骨髓起源成骨干細胞使心肌梗死鼠30%～40%心功效得到改進。

——Kocher.NatMed.,7:430-436

干細胞工程專題知識第80頁81心臟有相當(dāng)數(shù)量干細胞，這些細胞可分化為心肌細胞，病理組織學(xué)觀察顯示，有0.015%心肌細胞處于有絲分裂期，心肌梗死時為0.08%。——

Anversa.Nature.,415:240-243

干細胞工程專題知識第81頁82在性別不匹配心臟移植中可見受者循環(huán)中干細胞能移居并定位于移植心臟，生成新心肌纖維。

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Quain.NEngl.J.Med,,344(23):1750-1757干細胞工程專題知識第82頁83新近研究表明，成體非心臟起源干細胞，如骨髓、腦、骨骼肌、脂肪組織、肝臟和外周血干細胞，經(jīng)過自然遷移或試驗植入心臟均可分化為心肌細胞，提醒成體干細胞可成為心肌梗死后再生心肌細胞，當(dāng)前已很快進入臨床研究。

干細胞工程專題知識第83頁84成體干細胞及其子代細胞移植或動員腦組織內(nèi)干細胞治療神經(jīng)退行性疾病已獲初步成效。動物試驗證實移植神經(jīng)元可替換修復(fù)已損壞神經(jīng)通路。臨床試驗也證實細胞替換治療可使癥狀緩解。

干細胞工程專題知識第84頁85帕金森病主要病變是黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元退行性變，給病人紋狀體內(nèi)移植胎兒中腦組織結(jié)果顯示，移植神經(jīng)元能夠存活并恢復(fù)對紋狀體神經(jīng)支配達10年。因為倫理、起源等問題，大量臨床應(yīng)用有困難。

干細胞工程專題知識第85頁86用干細胞和生長因子修復(fù)骨折，可加速愈合。動物試驗顯示，從骨髓提取干細胞能改進治療效果。用干細胞治療癱瘓病人，已經(jīng)有成功病例匯報。分離出毛囊干細胞與“誘導(dǎo)”真皮細胞結(jié)合可產(chǎn)生新毛囊。

干細胞工程專題知識第86頁87有些人將干細胞當(dāng)成“未來疾病治療新希望”；也有些人懷疑“干細胞治療：是新希望還是錯誤開端”，理由是不一樣試驗結(jié)果無法證實骨