圖位克隆的基本原理和方法何宗順2011.12.71圖位克隆的基本原理其基本的原理是：功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，通過找到與目標性狀緊密連鎖的分子標記，在利用分子標記技術(shù)對目的基因精細定位的基礎(chǔ)上，由于水稻全基因組序列的發(fā)布，我們可以得到已定位區(qū)段的候選基因，通過對候選基因進行分析，確定目標基因，最后經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化試驗證實目的基因功能。2圖位克隆的步驟：PrimarymappingFinemappingCandidategeneComplementationtestFunctionalanalysis3PrimarymappingprimarymappingmethodandMappingpopulation

4作圖群體將純合突變體與ZS97進行雜交，對雜交的種子進行基因型鑒定，找到雜合型種子（即種子能夠發(fā)生分離），將雜合F1代種子種下去后就能得到F2代群體。5R/Rr/rR/R

R/rF2

×

R/r

r/rF1

P1

純合突變體P2ZS97

6primarymappingmethodBulkedSegregmentAnalysis：群組分離分析法。原理是將分離群體(F2、BC1等)中的個體依據(jù)研究的目標性狀(如抗病、感病)分成兩組，每一組取樣8-15份，在每一組群體中將各個體DNA等量（等濃度等體積）混合，形成兩個DNA池(如抗病池和感病池)。同時需要構(gòu)建兩個親本（ZH11/ZS97）的BSA池。由于分組時僅對目標性狀進行選擇，因此兩個池間理論上就應主要在目標基因區(qū)段存在差異。7ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)HY1(W)HY1(M)HY2(W)HY2(M)HY3(W)HY3(M)HY5(W)HY5(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)將構(gòu)建的BSA池分別用本室的255對在親本ZH11/ZS97間存在多態(tài)性的SSR標記進行PCR擴增，經(jīng)過跑PAGE膠找到與目標性狀緊密連鎖的標記。8找到緊密連鎖的分子標記之后我們就要進行一個“陽性”檢測：即檢測這個找到的分子標記是不是真正的與目標性狀連鎖。我們對F2代群體中隨機選取一個200左右的小群體，將找到的分子標記分別擴增這些樣，看表型與基因型是否對應。同時我們可以用這個小群體進行一個初步的基因定位。9Finemapping一.表型觀察二.篩選交換單株三.開發(fā)新的分子標記10R/Rr/rR/R

R/rF2

×

R/r

r/rF1

P1

純合突變體P2ZS97

正常表型突變表型11ZH11：“A”ZS97：“B”交換有兩種帶型：H和B12單株12345678910M1M2M3M4M5

HAAB

HAAAAB

HAABAAAAAAAAAAAAAAAAAHAAAB

HHAAAHHAAB

B

H

BA基因和表型相對應！13開發(fā)新的標記：新的SSR標記：

/modules/redbtools/ssrscan.php，運行SSRScan就會得到該段序列的簡單重復序列。InDel/Caps標記：將要開發(fā)標記的日本晴區(qū)段序列與93-11做一個blast，選取插入或者缺失比較大的位點設(shè)計引物。SNPS標記:可以通過測序找到在ZH11/ZS97間存在單堿基差異的位點，或者找謝老師咨詢。14Candidategene將最后精細定位區(qū)段在/cgi-bin/gbrowse/rice/中輸入定位區(qū)間的物理位置，即可顯示出候選基因。1516精細定位擴大群體，進行精細定位17找到候選基