流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第1頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二主要內(nèi)容流式細(xì)胞儀概述流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀的應(yīng)用檢測(cè)的一般步驟第2頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、流式細(xì)胞儀概述第3頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀種類BDFACSVantageBD-CaliburEpicsAltra第4頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二EpicsAltraBeckmanCoulter第5頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀的定義流式細(xì)胞儀是指，使細(xì)胞（或其他粒子）以單個(gè)方式依次高速通過(guò)激發(fā)光束，采集細(xì)胞被光照時(shí)產(chǎn)生的各種信號(hào)，對(duì)信號(hào)進(jìn)行處理，并對(duì)各參數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的一種儀器。第6頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二利用流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學(xué)特性并通過(guò)這些特性對(duì)細(xì)胞或顆粒進(jìn)行定量。

檢測(cè)表面標(biāo)記物檢測(cè)胞漿標(biāo)記物檢測(cè)胞核內(nèi)標(biāo)記物檢測(cè)可溶性蛋白流式細(xì)胞術(shù)（FLOWCYTOMETRY）第7頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)前向散射側(cè)向散射第8頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀顯微鏡流動(dòng)的細(xì)胞靜止的細(xì)胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細(xì)胞群體特征量分布可以揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息特殊的顯微鏡第9頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二高速測(cè)定細(xì)胞，大樣本計(jì)數(shù)檢測(cè)稀有細(xì)胞多參數(shù)分析自動(dòng)化細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀的主要特點(diǎn)第10頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、流式細(xì)胞儀工作原理第11頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀通常以激光作為激發(fā)光源，經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號(hào)被光電二極管和光電倍增管接收，之后轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過(guò)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，最后由計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算處理。第12頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二儀器基本組成流路流動(dòng)室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5105-1106個(gè)/ml光路光源濾片光電倍增管PMTHV電路放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計(jì)

計(jì)算機(jī)第13頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流路InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流動(dòng)室第14頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀光路圖Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流動(dòng)室第15頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二激光配置488nm氬離子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器第16頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光路-濾片特性長(zhǎng)通濾片–允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過(guò)短通濾片–允許短于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過(guò)帶通濾片–允許一定帶寬的波長(zhǎng)通過(guò)當(dāng)以

45o

角放置濾片時(shí),該濾片可以通過(guò)一定波長(zhǎng)的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長(zhǎng)以下的光，這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)630nmBandPassFilterWhiteLightSource第17頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光信號(hào)收集光信號(hào)分離，導(dǎo)向，各探測(cè)通道PMT接收并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細(xì)胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光第18頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二數(shù)據(jù)處理FSCSSC

FL1FL2FL3對(duì)數(shù)

線性線性

線性

對(duì)數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號(hào)電信號(hào)記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果（面積，峰高，寬度）第19頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二顆粒度細(xì)胞大小流式細(xì)胞儀產(chǎn)生的信號(hào)非熒光信號(hào)第20頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二FL1–FITC,GFP…(PMT2)FL2–PE(PMT3)FL3–ECD,PI…(PMT4)FL4–PC5,APC…(PMT5)熒光信號(hào)第21頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞表面的抗原(或細(xì)胞膜受體)與相關(guān)的熒光抗體結(jié)合，形成帶有熒光的抗原抗體復(fù)合物。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定其熒光量，即可得到細(xì)胞群的不同抗原位點(diǎn)表達(dá)情況。原理第22頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二488nm空冷激光：

FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、

PerCP、EGFP、EYFP、AO、TO、Fluo3633nm空冷激光：

APC、APC-CY7、CY590-4水冷激光：UV（333-364nm）

HOECHST33342、DAPI…第23頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、流式細(xì)胞儀應(yīng)用第24頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀應(yīng)用淋巴細(xì)胞免疫功能測(cè)定干細(xì)胞研究細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)細(xì)胞周期及倍體分析細(xì)胞活性分析細(xì)胞分選

……第25頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二淋巴細(xì)胞亞群活化的T淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞調(diào)控性T細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞先天免疫細(xì)胞細(xì)胞免疫功能測(cè)定第26頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞群CD抗原

T細(xì)胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B細(xì)胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75

髓系細(xì)胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK細(xì)胞CD16CD56CD57CD94

血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63

激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97

粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f

內(nèi)皮細(xì)胞CD105CD106CD109

細(xì)胞因子受體CD25CD115CD117CD122CD126CD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群第27頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項(xiàng)目和意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴(yán)重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低腫瘤降低降低增高降低降低第28頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二用熒光標(biāo)記抗體抗體特異性地結(jié)合細(xì)胞上對(duì)應(yīng)的抗原表達(dá)該抗原的細(xì)胞被標(biāo)記上熒光；抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞百分比或濃度靶蛋白濃度第29頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二淋巴細(xì)胞CD抗原的流式細(xì)胞檢測(cè)第30頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二造血系統(tǒng)干細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞脂肪干細(xì)胞…………干細(xì)胞研究第31頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熱門(mén)研究－(腫瘤)干細(xì)胞腫瘤組織無(wú)限制的增殖在于腫瘤干細(xì)胞的存在目前研究的腫瘤干細(xì)胞來(lái)源于前列腺、乳腺等腫瘤腫瘤干細(xì)胞數(shù)量稀少，常規(guī)方法很難檢測(cè)目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞和正常細(xì)胞在HOECHEST33342染料攝取方面有重大差別故流式細(xì)胞儀是分析和檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞的重要工具第32頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二干細(xì)胞能表達(dá)ABCG2泵蛋白，在HOECHST33342染色時(shí)能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色的細(xì)胞群時(shí)可以發(fā)現(xiàn)一群不能染色的細(xì)胞既是干細(xì)胞，因此能夠在眾多腫瘤細(xì)胞中區(qū)分出腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞中的研究應(yīng)用

-Hoechst33342sidepopulation第33頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二HoechstHoechst+Vera.SidePopulationCells第34頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞凋亡研究1.鑒別凋亡與壞死:AnnexinⅤ/PI2.測(cè)定凋亡率:AnnexinⅤ、Apo2·7、TUNEL3.研究凋亡觸發(fā)機(jī)制：Caspase、Fas及FasLbcl-2/bax4.多參數(shù)分析凋亡是趨勢(shì)第35頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第36頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二G1SphaseG2MG1121DNA含量

DNA含量細(xì)胞周期時(shí)相G0/1G2/MS細(xì)胞數(shù)細(xì)胞周期分析第37頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二PIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，需要固定打孔488nm激發(fā)為脂溶性，主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞UV激發(fā)常用的DNA染料第38頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二DNA含量及細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析:在細(xì)胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個(gè)時(shí)期，DNA的含量隨各時(shí)相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過(guò)核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.第39頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二G0/G1SG2/M第40頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀分選電荷式分選是當(dāng)前的主流分選模式高速分選是保證結(jié)果的基本條件高純度和高活性是分選的基本要求可選的激光要多樣化（空冷、水冷、固體；不同的波長(zhǎng)；真正的紫外）提供多種分選流動(dòng)室光路穩(wěn)定，紫外激光功率大流式分選和磁珠分選的差別和聯(lián)系第41頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector電荷式細(xì)胞分選第42頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞分選的主要技術(shù)指標(biāo)分選速度：≧25000個(gè)細(xì)胞/秒分選純度：﹥98%

分選后細(xì)胞存活率：97%第43頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二BeforeSortingAfterSorting第44頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)的一般步驟第45頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二設(shè)置檢測(cè)方案（PROTOCOL)染色標(biāo)本（同型對(duì)照，補(bǔ)償管，檢測(cè)抗體）同型對(duì)照管調(diào)電壓電壓不變，補(bǔ)償管調(diào)補(bǔ)償電壓不變，補(bǔ)償不變，上檢測(cè)管檢測(cè)后直接閱讀結(jié)果檢測(cè)的一般步驟第46頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電壓調(diào)節(jié)－利用同型對(duì)照：設(shè)置背景電壓volts增益Gain設(shè)定陰性和陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度的臨界點(diǎn)第47頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光補(bǔ)償

Needtodowhenwemeasuresignalsfrommorethan1fluorescence.FITC520BPPE575BP第48頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5第49頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二補(bǔ)償PEFITCPE+cellsFITC