高級生物化學黃劍目前一頁\總數六十六頁\編于十四點第一章蛋白質的結構與功能

蛋白質譯自Albuminoid，該詞來自拉丁文Albumina（蛋白）。1838年，德國化學家Mulder建議采用Protein一詞，立即得到瑞典著名化學家Berzelius的支持，逐漸被學術界普遍采用，該詞源自希臘文προτο（proteios），意為最原始、最基本、最重要的?？梢?，蛋白質自發(fā)現后一直受到化學家和生物學家的重視。因為蛋白質是活細胞中含量最豐富、功能最復雜的生物大分子，是各種生物功能主要的體現者。近代生物化學及分子生物學研究表明，蛋白質是由20種左右的α-氨基酸通過肽鍵相互連接而成的一類具有特定的空間構象和生物學活性的高分子有機化合物。它廣泛存在于生物界，是塑造一切組織和細胞結構必不可少的組成成分，是生命的支柱；每種蛋白質在實現細胞內協(xié)調一致的活動中扮演著各自特定的角色，如參與細胞結構的建造，起支持和保護作用。生命的最基本特征是能夠進行新陳代謝，新陳代謝所包括的一切化學反應都是在生物催化劑——酶的作用下完成的；幾乎所有的酶都是蛋白質。目前二頁\總數六十六頁\編于十四點

蛋白質是以核酸為模板合成的，是基因表達的主要產物，因此人們將核酸稱為“遺傳大分子”，而把蛋白質稱為“功能大分子”。近50年來，以核酸-蛋白質的結構、功能及其相互關系為中心，逐漸形成了分子生物學，成為帶領生命科學進入新時代的龍頭。蛋白質是20種天然氨基酸縮合成的大分子，分子量從10kDa至數百kDa，有著極其復雜的結構。1952年丹麥生物化學家Linderstrom-Lang提出蛋白質三級結構概念，把蛋白質研究納入正軌。

目前三頁\總數六十六頁\編于十四點

越來越多的證據雄辯地表明：蛋白質的功能與其特殊的結構有著十分密切的內在聯系，結構是特定功能的內在依據，功能則是特定結構的外在表現。

因此，闡明蛋白質的分子結構及其與功能的關系是現代生物化學的基本命題，是揭示生命運動規(guī)律的必由之路，應當受到所有生命科學工作者的關注。目前四頁\總數六十六頁\編于十四點1蛋白質的基本組成單位——氨基酸

氨基酸(aminoacid)是一類分子中含有氨基的羧酸，廣泛分布于生物界。目前從各種不同的生物體中發(fā)現的氨基酸已有250多種，其中有20種是蛋白質分子結構的基本成分，可稱為蛋白質氨基酸；更多的氨基酸則以游離形式存在，不參與蛋白質的結構組成，稱為非蛋白質氨基酸。本節(jié)將以蛋白質氨基酸為中心，對它們的結構和性質進行分析和討論。

1819年，法國化學家布拉孔諾(H·Braconnot)把纖維素放在酸里加熱，成功地把纖維素水解為葡萄糖，從而知道纖維素是由許許多多的葡萄糖“手拉手”組成的，因此他想，能不能像研究纖維素那樣來研究蛋白質的組成呢?首先他把明膠放在酸里加熱，結果從酸水解液中分離到一種分子量比蛋白質小得多的含氮化合物，后來取名為甘氨酸；他又用同樣方法從肌肉水解液中提取出另一種含氮化合物，因它的結構中含氨基和羧基，故取名為氨基酸。目前五頁\總數六十六頁\編于十四點1.1氨基酸的分子結構

1.1.1蛋白質氨基酸

在蛋白質水解液中分離出來的氨基酸有20種，它們都屬α-氨基酸，除脯氨酸外，在與羧基相連的α-碳原子上都有1個氨基。其分子結構的通式表示如下目前六頁\總數六十六頁\編于十四點目前七頁\總數六十六頁\編于十四點目前八頁\總數六十六頁\編于十四點

脯氨酸與一般的α-氨基酸不同，它沒有自由的α-氨基，是一種α-亞氨基酸，可以看作是α-氨基酸的側鏈基團(-CH2CH2CH3)取代了自身氨基上的一個氫原子而形成的雜環(huán)結構。脯氨酸的分子結構表示如下：α-氨基酸脯氨酸目前九頁\總數六十六頁\編于十四點

天然的α-氨基酸除甘氨酸外，α-碳原子均為不對稱碳原子。有的α-氨基酸可能含有兩個或兩個以上的不對稱碳原子，因此它們都有旋光性，分為D-型和L-型兩種異構體。對這一類氨基酸的立體化學研究證明，所有帶α-氨基的碳原子都具有相同的構型，而且這些構型和L-(-)甘油醛相同(見下圖)。因此，這些氨基酸均屬L-α-氨基酸，這是蛋白質氨基酸分子結構的共同特征。目前十頁\總數六十六頁\編于十四點

根據20種蛋白質氨基酸分子結構的這種特點，可按R基團的化學結構，將其分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族氨基酸三類。脂肪族氨基酸:有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨、谷氨酸、賴氨酸及精氨酸；芳香族氨基酸:有苯丙氨酸及酪氨酸；雜環(huán)族氨基酸:有色氨酸、組氨酸及脯氨酸。目前十一頁\總數六十六頁\編于十四點脂肪族氨基酸雜環(huán)氨基酸芳香族氨基酸目前十二頁\總數六十六頁\編于十四點

氨基酸的R基團的結構不同，使各種氨基酸具有不同的性質。實際上，蛋白質的許多性質、結構和功能等在很大程度上與氨基酸的R基團密切相關。根據20種氨基酸R基團的極性和解離性質，可將它們分為以下4組：

(1)非極性R基團氨基酸：該組氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸及脯氨酸等8種。它們的側鏈均為非極性基團，呈現疏水性目前十三頁\總數六十六頁\編于十四點非極性R基團氨基酸：側鏈基團均為非極性基團，呈現疏水性。目前十四頁\總數六十六頁\編于十四點（2）不解離的極性R基團氨基酸這一組包括絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺及甘氨酸等7種。它們的側鏈中含有不解離的極性基團，能與水形成氫鍵。因此比非極性R基團氨基酸易溶于水。

目前十五頁\總數六十六頁\編于十四點

(3)荷正電R基團氨基酸共有3種。其中賴氨酸除α-氨基外，在烴鏈ε位上還有一個氨基；精氨酸含有一個胍基；組氨酸有一個弱堿性的咪唑基。這一組氨基酸的R基團在pH7溶液中，可質子化而使分子帶正電荷。因此，通常將這3種氨基酸稱為堿性氨基酸。目前十六頁\總數六十六頁\編于十四點(4)荷負電R基團氨基酸該組氨基酸有2種，即谷氨酸和天冬氨酸。它們都含有兩個羧基，即除α-羧基外，在側鏈上還有一個非α-羧基。在pH7環(huán)境中，側鏈羧基可完全解離，使分子帶負電荷。因此，這一組氨基酸也稱作酸性氨基酸。

目前十七頁\總數六十六頁\編于十四點1.1.2非標準蛋白質氨基酸

在蛋白質的氨基酸組成分析時，發(fā)現某些蛋白質除了上述20種標準氨基酸外，還含有其他結構形式的氨基酸。這些特殊的氨基酸不具有獨立的遺傳密碼，它們是在蛋白質多肽鏈翻譯過程中，通過相應的標準氨基酸殘基的化學修飾而形成的。它們的存在與蛋白質的結構和功能有著密切的關系。目前十八頁\總數六十六頁\編于十四點

蛋白質中所含的非標準氨基酸最突出的例子是4-羥脯氨酸(4-hydroxyproline)及5-羥賴氨酸(5-hydroxylysine)，它們是纖維狀蛋白質——膠原的重要結構成分。目前十九頁\總數六十六頁\編于十四點一些與核酸結合形成復合物的蛋白質，它們的某些氨基酸殘基往往被化學修飾。例如核糖體蛋白質及染色體蛋白質(組蛋白)中的氨基酸常被甲基化、乙?；蛄姿峄?，形成相應的氨基酸衍生物，如3-甲基組氨酸、O-磷酸絲氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、ω-N-甲基精氨酸、N-乙酰絲氨酸、ω-N,N,N-三甲基賴氨酸、N,N,N一三甲基丙氨酸等。所有原核生物的蛋白質在生物合成之初，其N-末端殘基均為N-甲酰甲硫氨酸(N-formylmethionine)，隨后在蛋白質修飾成熟過程中被去除。目前二十頁\總數六十六頁\編于十四點在凝血酶原及某些具有結合Ca2+功能的蛋白質中，含有γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamicacid)。目前二十一頁\總數六十六頁\編于十四點在彈性蛋白中，發(fā)現含有一個結構更復雜的氨基酸——鎖鏈素(desmcosine)，它是賴氨酸的衍生物，由4個賴氨酸分子組成吡啶環(huán)，位于分子中央。目前二十二頁\總數六十六頁\編于十四點在甲狀腺球蛋白中，存在有碘化的酪氨酸殘基，它們可進一步修飾轉變，并經蛋白質降解生成甲狀腺素(thyroxine)和三碘甲腺原氨酸(triiodothyryronine)。

目前二十三頁\總數六十六頁\編于十四點1.1.3非蛋白質氨基酸（天然氨基酸）

在生物界還存在許多其他的氨基酸，其中多數以游離形式存在于生物的組織和細胞中，少數則與其他有機化合物結合，形成具有特定生物學活性的復合物。盡管當前對這一類氨基酸的生物學功能尚未完全了解，但對其中部分氨基酸的功能正在被闡明。目前二十四頁\總數六十六頁\編于十四點

據目前所知，非蛋白質氨基酸的生物學功能主要表現在以下幾方面：

(1)作為細胞與細胞之間信息傳遞的介質或參于物質代謝的調節(jié)。如γ

-氨基丁酸(-Aminobutyricacid)、甲狀腺素等。

(2)它們是物質代謝過程的中間產物或重要代謝物的前體，活潑地參與體內各種代謝反應。如鳥氨酸(ornithine)、瓜氨酸(citrullirne)、同型半胱氨酸(高半胱氨酸，homocysteine)、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylnlethionine)、β-丙氨酸等。目前二十五頁\總數六十六頁\編于十四點(3)具有特異的生理活性，是醫(yī)學上常用的抗生素或抗代謝藥物。如重氮乙酰絲氨酸(Azaserine)，它由一種鏈絲菌產生或合成，能抑制嘌呤的生物合成，導致染色體畸變。

(4)在不少生物體如細菌中，廣泛存在一類D型氨基酸，它們是微生物細胞壁的結構成分。實驗證明，D型氨基酸的存在，可降低細菌細胞壁對肽酶作用的敏感性，保護菌體不受酶作用的損害。目前二十六頁\總數六十六頁\編于十四點1.2氨基酸的理化性質

1.2.1氨基酸的兩性解離

氨基酸均為無色晶體或粉末狀，每種氨基酸都有自己特有的晶體形狀，可用于鑒定。與相應的有機酸相比，氨基酸的熔點較高，通常大于200oC，如甘氨酸為232oC，而相應的乙酸的熔點僅為16.5oC。氨基酸至少含有兩個可解離基團，具有可解離的側鏈基團者，則有3個解離基團。在某種pH環(huán)境中，氨基酸的羧基可解離釋放出質子，具有酸的性質；而它的氨基可以接受質子，具有堿的性質。因此，氨基酸既能與酸也能與堿反應，形成鹽，呈現兩性電解質的特性。目前二十七頁\總數六十六頁\編于十四點氨基酸與酸或堿反應的過程表示如下：由此可見，在水溶液中，一種氨基酸處在相對酸的條件下，帶正電荷；在相對堿的條件下，帶負電荷；當溶液的pH達到某一特定值時，該氨基酸則帶有相等的正電荷及負電荷，形成分子內鹽。此時的氨基酸凈電荷等于零，呈現電中性。處于電中性時的氨基酸稱偶極離子(dipolarion)或兼性離子(zwitterion)，此時溶液的pH值稱為等電點(isoelectricpoint，pI)。目前二十八頁\總數六十六頁\編于十四點pI值是氨基酸的一個特性參數。氨基酸在溶液中所帶電荷的性質決定于該氨基酸的pI值與溶液pH值的關系。當溶液的pH<pI時，氨基酸帶正電荷；當溶液的pH>pI時，氨基酸帶負電荷；當溶液的pH=pI時，氨基酸以兼性離子狀態(tài)存在。不同氨基酸因所含可解離基團，如氨基和羧基數目不同及各種基團相對解離程度(即解離常數K值，pK值)不一，其pI值也不相同。如果將不同pI值的各種氨基酸置于同一pH值的溶液中，它們呈現不同的帶電狀態(tài)。在實驗研究中，可借這一性質，應用離子交換層析或電泳法將不同氨基酸進行分離。目前二十九頁\總數六十六頁\編于十四點1.2.2氨基酸的化學反應

氨基酸分子中的氨基和羧基分別具有胺和羧酸的基本反應性質。氨基如同伯胺一樣，可以與酰鹵、酸酐、甲醛、亞硝酸等反應，形成相應的酰胺、亞胺結構或產生氮氣；羧基可以酯化和脫羧等；由于氨基與羧基同在一個分子上，它們相互影響，又呈現一些特殊的反應。此外，氨基酸側鏈的某些功能基團，如羧基、酚基、巰基、吲哚基、咪唑基、胍基以及硫甲基等，都可以和多種試劑發(fā)生反應。所有這些氨基酸反應是人工合成多肽和蛋白質、蛋白質化學修飾或是蛋白質和氨基酸分析定量的基礎，具有十分重要的實際應用價值。

目前三十頁\總數六十六頁\編于十四點(1)酰化反應氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生反應，氨基即被?；＠缗c芐氧甲酰氯(carbobenzyloxychloride，cbz-Cl)反應，反應式如下：氨基酸氨基中的一個氫原子被芐氧甲酰基(cbz)取代，生成cbz-氨基酸。這是化學合成多肽時一個重要的氨基保護反應。氨基酸的α-氨基被保護后，其羧基可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，反應式如下：此反應可使氨基酸的羧基活化，使之容易與另一氨基酸的氨基結合，因此常用于多肽化學合成。目前三十一頁\總數六十六頁\編于十四點

另一?；噭┦堑せ酋Ｂ?dansylchloride，DNS-Cl)，它與氨基酸的氨基反應生成DNS-氨基酸，反應式如下：

反應生成的DNS-氨基酸在紫外光下產生強烈的黃色熒光，有很高的靈敏度。因此該反應被用于多肽鏈氨基末端氨基酸的標記和微量氨基酸的定量測定。目前三十二頁\總數六十六頁\編于十四點(2)烴基化反應

氨基酸氨基的一個氫原子被烴基取代。例如與2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB)反應。該反應是氨基酸的α-氨基與DNFB在堿性溶液中反應，生成黃色的二硝基苯基氨基酸(DNP-氨基酸)。常用于鑒定多肽或蛋白質的氨基末端氨基酸（N-端）。反應式如下：弱堿性(pH8～9)、暗處、室溫或40℃條件下

目前三十三頁\總數六十六頁\編于十四點

另一個烴基化反應是氨基酸的α-氨基與苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate，PITC)在弱堿性條件下反應，形成相應的苯氨基硫甲酰(phenylthiocarbamyl，PTC)衍生物。后者在硝基甲烷中與酸作用，環(huán)化生成相應的苯乙內酰硫脲(phenylthiohydantoin，PTH)衍生物。該反應多用于鑒定多肽及蛋白質的氨基末端氨基酸，在蛋白質及多肽氨基酸序列分析中占有重要地位。目前三十四頁\總數六十六頁\編于十四點(3)甲醛反應

氨基酸與甲醛反應生成二羥甲基氨基酸。反應中使氨基酸的氨基被封閉，使羧基的酸性增強，可用強堿滴定之。此反應是用中和法測定氨基酸含量的依據，稱甲酸滴定法。

氨基酸既是酸又是堿，但不能直接用酸堿滴定法來測定其含量，因為它的酸堿滴定的等當點pH過高或過低，沒有適當的指示劑可用。如氨基酸的α-氨基的pK值為9.7左右，完全解離時，pH可達11或更高。在室溫和pH中性條件下，甲醛與氨基酸的α-氨基結合，生成羥甲基衍生物(H+一次放出)，從而降低了氨基的堿性。可選擇酚酞指示劑(變色范圍8.2～10)，用氫氧化鈉滴定放出的H+，因為每放出一個H+，就相當于有一個氨基氮，從氨基氮量可算出氨基酸的量。目前三十五頁\總數六十六頁\編于十四點(4)茚三酮反應茚三酮(ninhyrin)在弱酸性溶液(pH5~7)中與α-氨基酸共熱(80~100oC)，水合茚三酮與氨基酸縮合，經脫羧脫水產生亞胺

，再經水解得到醛和氨基茚三酮，最后另一分子水合茚三酮與反應產物——氨基茚三酮縮合，生成紫紅色產物。

茚三酮反應可用來鑒定與定量測定氨基酸，所有的α-氨基酸除脯氨酸外，都可顯紫紅色反應。谷氨酰胺和天門冬酰胺與茚三酮的反應產生棕紅色化合物。目前三十六頁\總數六十六頁\編于十四點1.2.3氨基酸的紫外吸收

組成蛋白質的20種氨基酸中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸因為它們的側鏈基團含有苯環(huán)共軛雙鍵結構，因此在紫外光區(qū)域(220～300nm)均有光吸收。酪氨酸的最大光吸收波長(λmax)在275nm，其摩爾消光系數ε275=1.4×103；苯丙氨酸的λmax為257nm，ε275=2.0×102；色氨酸的λmax為280nm，ε280=5.6×103。蛋白質多數含有這一類芳香族氨基酸，因此也具有紫外吸收能力，其最大吸收峰位于280nm。利用特定波長的紫外吸收性質，可用于蛋白質的定量分析。但不同蛋白質由于芳香族氨基酸含量不同，它們的摩爾消光系數不完全相同。因此，根據蛋白質溶液在280nm的吸光度(A280)換算溶液中蛋白質濃度，只是一個近似值。目前三十七頁\總數六十六頁\編于十四點2蛋白質的分子結構

2.1肽與肽鍵

2.1.1肽鍵與肽單元

許多實驗研究早已證明，蛋白質中氨基酸之間連接的基本方式是肽鍵(peptidebond)。肽鍵是由一分子氨基酸的α-羧基與另一分子氨基酸的α-氨基脫去1個分子水，縮合形成的共價鍵，屬一種酰胺鍵。許多α-氨基酸借助肽鍵彼此連接形成的化合物稱為肽(peptide)或肽鏈(peptidechain)。

肽鍵側鏈肽單元目前三十八頁\總數六十六頁\編于十四點

肽主鏈骨架實際上是由許多重復單位，即肽單元借助α-碳原子互相連接而成的。

目前三十九頁\總數六十六頁\編于十四點

肽鍵如同一般的酰胺鍵一樣，由于酰胺氮上的孤對電子與相鄰羰基之間的共振作用，呈現高度穩(wěn)定性。共振發(fā)生在以下兩種形式的肽鍵結構之間：

在肽鍵1中，C-N鍵是單鍵，氮原子上的孤對電子與羰基碳之間沒有電子云重疊，羰基碳是sp2雜化，而酰胺氮是sp3雜化。在肽鍵2中，羰基碳和酰胺氮之間是雙鍵，氮原子帶一正電荷，羰基氧帶一負電荷，羰基碳和酰胺氮都是sp2雜化，兩者都呈平面，即所有6個原子都處在同一平面上。肽鍵的實際結構是一個共振雜化體，是介于肽鍵結構1與2之間的平均中間態(tài)。目前四十頁\總數六十六頁\編于十四點

由于肽鍵是一個共振雜化體，其C=N的鍵長為0.132nm，介于單鍵(C-N鍵長0.148nm)和雙鍵(C=N鍵長0.127nm)之問。因此C-N鍵具有雙鍵性質，C-N鍵中的C及N不易繞鍵旋轉，于是使肽單元處于剛性平面簡稱肽鍵平面結構狀態(tài)。肽鍵的平面性質在肽鍵折疊成三維構象的過程中起著極為重要的作用。

目前四十一頁\總數六十六頁\編于十四點2.1.2肽鏈

肽鏈中的氨基酸，因為與前后相連的氨基酸形成肽鍵，它們每一個分子均少2個氫原子和1個氧原子，故稱為氨基酸殘基(aminoacidresidue)。目前四十二頁\總數六十六頁\編于十四點

最簡單的肽由兩個氨基酸組成，稱為二肽。含有3個、4個、5個氨基酸的肽，分別稱為三肽、四肽、五肽等。一般把小于10個氨基酸組成的肽稱為寡肽，而大于10個或10個以上氨基酸組成的肽稱為聚肽或多肽。肽的命名是根據參與其組成的氨基酸殘基來確定的，規(guī)定從肽鏈的－NH2末端氨基酸殘基開始，稱為某氨基酰、某氨基酰…某氨基酸。例如由丙氨酸殘基、酪氨酸殘基和谷氨酸殘基組成的三肽(Ala—Tyr—Glu)，稱為丙氨酰酪氨酰谷氨酸。在書寫肽鏈結構時，通常把－NH2末端的氨基酸殘基寫在左邊，－COOH末端氨基酸殘基寫在右邊。目前四十三頁\總數六十六頁\編于十四點

肽鏈結構所首先具有最重要的一個特點是不對稱性，或稱方向性。首先這種不對稱性主要表現在兩方面：一是任何開鏈肽，只有一個游離的α-NH2端，稱氨基末端或N端，位于肽鏈的左端；一個游離的α-COOH端，稱為羧基末端或C端，位于肽鏈的右端；二是肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，不同的肽具有不同的氨基酸組成和序列，這是構成蛋白質結構多樣性的基礎。其次，由于組成肽鏈的氨基酸不同，不同的氨基酸側鏈基團具有不同的解離性質，故不同的肽也呈現不同的解離行為，在溶液中表現出不同的荷電性質。再次是不同的側鏈結構和性質可直接影響肽鏈在三維空間上的構象。目前四十四頁\總數六十六頁\編于十四點2.1.2天然活性肽

肽鏈是構成蛋白質分子的基礎。蛋白質肽全是無分支的開鏈多肽。在生物體內還有一些游離存在的肽，它們各具有不同的生物學活性，通常稱為活性肽。如一些肽類激素(催產素、加壓素、抗利尿激素等)、抗生素(短桿菌肽S、放線菌素D、粘菌素E等)、肽類毒素以及其他具有重要生理作用的活性小肽等。目前四十五頁\總數六十六頁\編于十四點

自然界中存在的肽有開鏈式和環(huán)狀結構。在游離存在的活性肽中，有的在結構上與蛋白質肽有著顯著區(qū)別。如某些蕈類產生的肽類毒素——α-鵝膏蕈堿(α-amanitill)，是一個環(huán)狀八肽，能抑制真核生物RNA聚合酶活性，從而抑制核糖核酸（RNA）的合成，導致機體死亡。再如在微生物中常見的環(huán)狀肽短桿菌肽S，對革蘭式陽性細菌有強大的抑制作用。目前四十六頁\總數六十六頁\編于十四點

人和其他動物細胞內存在的谷胱甘肽(glutathione)，即γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，分子中的谷氨酸以其γ-羧基與半胱氨酸的α-氨基形成肽鍵，它在細胞中可參與可逆的氧化還原反應。目前四十七頁\總數六十六頁\編于十四點2.2蛋白質的一級結構

由氨基酸首尾共價相連而生成的肽鏈是蛋白質分子的結構基礎，所有的蛋白質都是在此基礎上進一步構造而成的?？梢韵胂?，由眾多數目的氨基酸組成，由各種不同排列的氨基酸順序，而且還將在三維空間上進行構造，最終形成的蛋白質分子的結構是非常復雜的。要研究和剖析這類大分子化合物的結構

，必須在方法學和策略上加以合理的設計。

長期以來，生物化學家們一直采用4個不同的結構層次來分析和描述蛋白質分子的結構狀態(tài)，即一級結構、二級結構、三級結構及四級結構。

所謂蛋白質分子是指具有完整生物學功能的蛋白質的最小單位。有的蛋白質分子，如肌紅蛋白、溶菌酶、細胞色素C、核糖核酸酶、羧肽酶A、木瓜蛋白酶等，僅由1條具有三級結構的肽鏈所構成；有的蛋白質分于，如血紅蛋白、乳酸脫氫酶、天冬氨酸轉氨甲酰酶、磷酸甘油醛脫氫酶等，是由多條具三級結構的肽鏈相互聚合而成，這些蛋白質就是屬于四級結構的蛋白質分子。目前四十八頁\總數六十六頁\編于十四點1952年，丹麥生物化學家Linderstrom-Lang把蛋白質的分子結構劃分為三個不同的組織層次（level,hierarchy）：一級結構（primarystructure）：指多肽鏈中氨基酸殘基的數目、組成及其排列順序（N-端→C-端），即由共價鍵維系的多肽鏈的二維（線性）結構，不涉及空間排列。二級結構（secondarystructure）：是多肽鏈主鏈（backbone）在氫鍵等次級鍵作用下折疊成的構象單元或局部空間結構，未考慮側鏈的構象和整個肽鏈的空間排布。三級結構（tertiarystructure）：則指整個肽鏈的氨基酸殘基側鏈基團互相作用以及與環(huán)境間的相互作用下形成的三維結構。1958年英國晶體學家Bernal發(fā)現寡聚蛋白由具有三級結構的亞基在次級鍵作用下結合而成，遂把寡聚體內亞基的空間排列稱為四級結構（quaternarystructure）。目前四十九頁\總數六十六頁\編于十四點

上述蛋白質分子一、二、三、四級結構的概念已被國際生物化學與分子生物學學會命名委員會正式采納和定義。60年代以后，隨著對蛋白質分子結構知識的積累，又增加了不少新的內容。如在三級結構以上又增加了四級結構，在二級和三級結構之間又增加了超二級結構和結構域這兩個結構層次。

1973年Rossman發(fā)現相鄰的二級結構往往形成某種有規(guī)律的、空間上可辯認的、更高層次的折疊單元，稱為超二級結構（super-secondarystructure）或折疊單元（foldingunit），主要涉及這些構象元件在空間上如何聚集。與此同時，Wetlaufer觀察到蛋白質分子中存在相對穩(wěn)定的球狀亞結構，其間由單肽鏈相互連接，命名為結構域（structuraldomain）。目前五十頁\總數六十六頁\編于十四點蛋白質分子的結構層次：A、一級結構，B、二級結構，C、結構域，D、三級結構，E、四級結構，F、大分子子組合體目前五十一頁\總數六十六頁\編于十四點球狀蛋白分子結構的不同水平圖中A代表組成一級結構的各種氨基酸；S和sS分別代表蛋白質中的二級結構和由它們組合成的超二級結構；D/T表示蛋白質的結構域，如果是單結構域的蛋白質，此結構域即蛋白質的三級結構；同樣，T/α表示由結構域構成的蛋白質的三級結構或亞基；Q代表蛋白質的四級結構，可以是n個相同亞基α裝配成的同源聚集體，也可以是n個α亞基和m個β亞基（甚至更多種亞基）形成的異源聚集體。目前五十二頁\總數六十六頁\編于十四點

天然蛋白質都具有獨特而穩(wěn)定的三維結構，即構象(conformation)。構象是指分子內各原子或基團之間的相互立體關系。構象的改變是由于單鍵的旋轉而產生的，不需有共價鍵的變化(斷裂或形成)，但涉及到氫鍵等次級鍵的改變。1969年國際純化學和應用化學聯合會(IUPAC)規(guī)定在描述蛋白質等生物大分子的空間結構時應使用構象一詞。按照這種劃分，二級結構以上的結構都屬于構象的范疇。構型(configturation)，是指在立體異構體中，取代基團或原子因受某種因素的限制，在空間取不同位置所形成的不同立體結構。構型的改變必須有共價鍵的斷裂。如幾何(順反)異構體中，取代基團因受雙鍵的限制，而有順式和反式兩種構型；在光學異構體中，a碳原子上的四個基團不同，只可能取兩種不同的空間排布，這兩種不同的空間排布稱為不同的構型。目前五十三頁\總數六十六頁\編于十四點2.2.1蛋白質一級結構

蛋白質的一級結構(primarystructure)又稱為共價結構、化學結構。不同的蛋白質都具有特定的構象，但從一級結構來看，蛋白質是由許多的氨基酸按照一定的排列順序，通過肽鍵相互連接起來的多肽鏈結構。1969年，IUPAC曾規(guī)定蛋白質的一級結構是指肽鏈中的氨基酸排列順序和連接方式。它是蛋白質分子結構的基礎，包含了決定蛋白質分子所有結構層次構象的全部信息。如果蛋白質分子中存在二硫鍵，一級結構也包括形成二硫鍵的半胱氨酸殘基的位置。一級結構即氨基酸序列是區(qū)別不同蛋白質最基本、最重要的標志。一級結構決定了蛋白質的三維空間構象。目前五十四頁\總數六十六頁\編于十四點

胰島素(insulin)是由人和其他哺乳動物胰島β-細胞合成釋放的蛋白質激素，具有促進葡萄糖氧化利用和轉變成糖原儲存，降低血葡萄糖濃度的作用，是調節(jié)糖、脂類和蛋白質代謝的重要激素。胰島素分子的一級結構由A鏈和B鏈兩條肽鏈組成，其中A鏈含21個氨基酸，N端為甘氨酸、C端為天冬酰胺；B鏈含30個氨基酸，N端為苯丙氨酸，C端為丙氨酸。整個分子含有3個二硫鍵，其中1個位于A鏈內，2個位于A、B鏈之間。目前五十五頁\總數六十六頁\編于十四點

多肽鏈可取3種不同的一級結構形式，即無支鏈開鏈多肽、分支開鏈多肽和環(huán)狀多肽。某些天然多肽種含有蛋白質中不常見的或不存在的氨基酸，如β-氨基酸、D型氨基酸等，這些結構上的變化可能起保護這些多肽免受蛋白水解酶降解的作用。

目前五十六頁\總數六十六頁\編于十四點2.2.2蛋白質一級結構研究進展

蛋白質的一級結構即多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序（N-端→C-端）是由基因編碼的，是蛋白質高級結構的基礎，因此一級結構的測定成為十分重要的基礎研究。

1945～1955年，英國生物化學家Sanger率先完成了人胰島素的序列測定，從而揭開了蛋白質一級結構研究的序幕。

1950年，瑞典科學家Edman發(fā)明了以他的名字命名的N-端測定法，并與Begg在1967年發(fā)明了序列儀，極大地推動了蛋白質一級結構的測定工作。盡管如此，蛋白質一級結構測定仍是一項相當耗費時間和資金的工作。因而測序方法和技術的改進與創(chuàng)新勢在必行。。目前五十七頁\總數六十六頁\編于十四點一級結構測定的基本方法有如下幾種：1、獲取一定量純的蛋白質樣品，且分子量已知：將一部分樣品完全水解，確定該蛋白中的氨基酸種類、數目和每種氨基酸的含量。

2、進行末端分析確定該種蛋白質的肽鏈數目，N-端和C-端各是什么氨基酸。

(1)N-末端分析①2,4-二硝基氟苯（FDNB）法②Edman降解法③5-二甲氨基萘-1-磺酰氯法（丹磺酰氯法，DNS）

(2)C-末端分析

①肼解法（NH2NH2）②羧肽酶法(Carboxypeptidasemethod，CPE法)

目前五十八頁\總數六十六頁\編于十四點

3、肽鏈的拆分經末端分析，若該種蛋白質有兩條以上的肽鏈組成時應將其拆分開。如果肽鏈之間通過非共價鍵連接，可使用一切使蛋白質變性的試劑。如果肽鏈之間通過共價鍵相連(主要是二硫鍵)，可采用過甲酸氧化或巰基乙醇還原的方法。

4、肽鏈中氨基酸排列順序的確定一般使用片段重疊法。一些專一性的蛋白水解酶或化學試劑，能使蛋白質的多肽鏈在特定的部位斷裂，產生一些大小不同的重疊片段，分離純化這些肽段，測定每一個肽段的氨基酸順序，根據這些重疊的片段，推斷出完整肽鏈的氨基酸排列順序。

目前五十九頁\總數六十六頁\編于十四點常用的斷裂多肽鏈的方法有以下幾個：①溴化氰(CNBr)裂解法：它專一性水解甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。溴化氰水解的結果產生以高絲氨酸內酯結尾的肽，高絲氨酸內酯是甲硫氨酸轉變來的。②胰蛋白酶水解法：胰蛋白酶專一性水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵。但是，如果賴氨酸和精氨酸的羧基與脯氨酸相連，則該酶不能作用。目前六十頁\總數六十六頁\編于十四點常用的斷裂多肽鏈的方法有以下幾個：③胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)水解法：它專一性水解疏水性氨基酸，主要是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的羧基形成的肽鍵。若與它們的羧基相連的氨基酸為脯氨酸，該酶不能水解。④胃蛋白酶水解法：它要求斷裂鍵兩側的氨基酸都是疏水性的氨基酸。⑤金黃色葡萄球菌蛋白酶(谷氨酸蛋白酶)水解法：它專一性水解谷氨酸和天門冬氨酸的羧基形成的肽鍵。⑥梭狀芽孢桿菌蛋白酶(精氨酸蛋白酶)水解法：它能水解精氨酸的羧基形成的肽鍵。目前六十一頁\總數六十六頁\編于十四點

5、分離純化部分降解的肽片段分析每一片段的氨基酸組成和排列順序。

6、確定二硫鍵的位置。

7、根據重疊肽的氨基酸順序，推出完整