大腸桿菌染色體DNA的分離及限制性內(nèi)切酶酶切目的：了解大腸桿菌染色體DNA制備和酶切的原理2.掌握制備大腸桿菌染色體DNA和DNA酶切的基本技術(shù)方法。原理：基因組DNA的分離和酶切是最常用的基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)，它可用作DNA物理圖譜制作、DNA文庫(kù)的建立、PCR擴(kuò)增、核酸雜交、限制性酶切片段多態(tài)性等諸多方面。DNA提取的主要步驟包括破碎細(xì)胞，去除蛋白、多糖、脂類等大分子，去除RNA分子，沉淀DNA,去除鹽、有機(jī)溶劑等雜物，純^NA等。大腸桿菌的染色體有4.7X103Kb，大約1mm長(zhǎng)。由于B型雙螺旋DNA的寬度只有10A，DNA分子對(duì)剪切力十分敏感。因此，分離純化DNA總的原則應(yīng)盡量保證DNA的完整性和排除其它污染，為此，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中：（1）簡(jiǎn)化步驟，縮短時(shí)間；（2）減少化學(xué)因素對(duì)DNA的降解，避免過(guò)酸過(guò)堿的條件；（3）減少機(jī)械剪切力及高溫的傷害；（40防止各種核酸酶對(duì)DNA的降解，通常需要在緩沖液中添加乙二胺四乙酸EDTA）以螯合Mg2+，Ca2+，這樣就會(huì)抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）的活性。本實(shí)驗(yàn)所采用的方法通常添加去垢劑sarcosyl或十二烷基肌氨酸鈉，使蛋白變性并溶解細(xì)胞膜中的脂質(zhì)從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，要從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化DNA常用RNA酶和蛋白酶（鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等）進(jìn)行水解處理。隨后用酚：氯仿進(jìn)行抽提，以去除殘留的蛋白質(zhì)，這時(shí)蛋白質(zhì)將進(jìn)入有機(jī)相，或者假如已變性的話將呈現(xiàn)在有機(jī)相與水相之間。乙醚處理是為了去除苯酚，而乙醇沉淀處理則可以濃縮NA，同時(shí)去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。本實(shí)驗(yàn)所采用的方法已成功地應(yīng)用于大腸桿菌和其他幾種革蘭氏陰性細(xì)菌（包括Rhizobia,Seeratia，和Vibriosp）的染色體DNA的抽提，而從其他類型的微生物（比如Bacillussp.和酵母）中分離染色體DNA的方法則有所不同，其主要區(qū)別之處在于裂解步驟的不同。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法分離得到的染色體）NA樣品易被限制酶切割，因此，較適用于Southern雜交的研究。如果所制備的染色體DNA是用于構(gòu)建克隆文庫(kù)，要求得到較大分子量的DNA，則必須省略其中的振蕩步驟。DNA（或RNA）分子中堿基的紫外吸收?qǐng)D譜在260nm處有一個(gè)特征吸收峰。這種吸收和系統(tǒng)中DNA（或RNA）量成正比。應(yīng)用1-cm光路，DNA在260nm波長(zhǎng)處的消光系數(shù)為20?；诖讼庀禂?shù)，1-cm石英比色皿中，在260nm下，1OD值相當(dāng)于50口g/ml雙鏈DNA、40口g/ml單鏈DNA或RNA及20口g/ml單鏈寡核苷酸溶液。260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值（A260/A280），可用來(lái)衡量DNA制劑的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0。紫外分光光度法是定量核酸的常用方法，要求核酸樣品是純凈白（即無(wú)顯著的蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。如果DNA樣品中有RNA，則A260/A280將高于1.8；如果樣品中有蛋白質(zhì)的污染，^UA260/A280將明顯低于此值；可將樣品純化后再作定量測(cè)定。有豐富實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的人，僅憑樣品電泳后溟化乙錠染色螢光帶的強(qiáng)度，即可大致判斷出樣品中的核酸含量，故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。II型DNA限制性內(nèi)切酶是一類可以識(shí)別并結(jié)合到雙鏈）NA的特異核酸序列上同時(shí)對(duì)其進(jìn)行水解切割酶，如EcoRI的識(shí)別序列為GAATTC。其以內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，結(jié)果分別在兩條雙鏈的末端留下5'端磷酸基團(tuán)和3'端羥基。在進(jìn)行限制性酶消化時(shí)，將雙鏈DNA分子與適量的限制性酶以及供應(yīng)商推薦的相應(yīng)的緩沖液中進(jìn)行混合保溫，并在該酶的最適溫度下進(jìn)行反應(yīng)。一個(gè)酶單位通常定義(依據(jù)供應(yīng)商)為1小時(shí)內(nèi)在合適的溫度下，尤其是37°C下，用于完全消化卻g雙鏈。阻的酶的數(shù)量。使用中一般以即gDNA對(duì)2—3u酶保溫1-4小時(shí)為宜。過(guò)程：1.大腸桿菌染色體DNA制備1.2ml菌液置于Eppendorf管內(nèi)，8000r/min離心15s。將菌體懸浮于0.31mlTHE緩沖液中，確保沒(méi)有菌塊。在菌體懸浮液中加入0.35ml2%十二烷基肌氨酸鈉。將離心管顛倒數(shù)次，充分混勻。加入5口lRNA酶，37C水浴保溫15min。再加入35口l蛋白酶K，在50C水浴加熱直至細(xì)胞裂解完全(30—90min)。旋渦振蕩細(xì)胞裂解液2min以剪切DNA，使DNA相對(duì)分子質(zhì)量下降為20kb左右并降低裂解液的粘度，使之更易于用苯酚：氯仿混合物及乙醚進(jìn)行抽提。酚：氯仿抽提：加入0.70ml苯酚：氯仿1:1的混合物，短暫(幾秒鐘)旋渦振蕩混合，高速離心3min，使其分層，將頂層部分小心移至一新的Eppendorf管中。小心，不要將白色絮狀的中間層吸入。再用苯酚：氯仿對(duì)含DNA的水層進(jìn)行兩次抽提。乙醚抽提(通風(fēng)櫥內(nèi)操作)：加0.70ml乙醚抽提，短暫旋渦振蕩，去上清。沉淀DNA：加入70口l醋酸鈉溶液，混勻，再加入0.7ml異丙醇，顛倒混勻5-6次。冰浴10min。離心5min，傾去上清。注意：如果回收DNA時(shí)任存在問(wèn)題，可以嘗試延長(zhǎng)離心時(shí)間。漂洗DNA沉淀：加入70%乙醇約1.0ml，稍加混勻，離心5min，傾去上清。重復(fù)兩次。此可除去殘存的鹽份及殘留的苯酚和氯仿。真空干燥以除去乙醇。溶解DNA沉淀于40口l的TE緩沖液中。作好標(biāo)記，-20C保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定同前實(shí)驗(yàn)4-1。DNA的濃度和純度測(cè)定：取5口lDNA溶液用TE(或dH2O)中稀釋至1ml。用TE(或dH2O)在紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)260、280和310nm處作空白校正零點(diǎn)。將DNA稀釋溶液裝入比色皿比色讀取上述三個(gè)波長(zhǎng)下的光密度?D)。記錄光密度數(shù)據(jù)，通過(guò)計(jì)算確定DNA的濃度和純度。對(duì)于雙鏈DNA分子，其濃度(JJg/pl)可以通過(guò)以下公式導(dǎo)出：[dsDNA]=50(OD260-OD310)*稀釋倍數(shù)/1000按步驟(1)稀釋，若(OD260-OD310)為0.1,則樣品DNA的濃度就為1pg/pl。這樣的稀釋非常便于計(jì)算。注釋：OD310是背景吸收：鹽濃度高，該值就高。DNA的OD260:OD280值應(yīng)該在1.8左右,如大于1.8，說(shuō)明存在RNA，可考慮用RNA酶處理；如小于1.6,說(shuō)明存在蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)用酚：氯仿抽提，乙醚抽提后，以乙醇沉淀純化DNA。限制性內(nèi)切酶酶切染色體DNA與鑒定-20°C冰箱中取出實(shí)驗(yàn)的樣品，讓其升至室溫。限制性酶消化是在特定的緩沖液中進(jìn)行的。緩沖液以10X濃縮貯存液供應(yīng)，使用時(shí)必須稀釋成1X緩沖液。反應(yīng)可以在50日l(shuí)總體積中進(jìn)行。在0.5mLEppendorf管中依次加入：TOC\o"1-5"\h\zddH2o34jL10X緩沖液爭(zhēng)LDNA10JL(1-3jg)BamHIHL加入所有組分后，蓋緊管口，輕彈混勻并在離心機(jī)上離心2-3秒鐘，將試劑甩至管底。