間接免疫熒光法測第1頁/共34頁間接免疫熒光法

檢測抗核抗體（ANA）制作人：XXX20XX-XX-XX第2頁/共34頁抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細胞及其成分的抗體【ANA】：指抗細胞核成分（DNA，RNA，蛋白質和酶）的抗體。ANA存在一個譜ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗體的總稱某些核抗原成分在核仁和胞漿內比核質內更豐富第3頁/共34頁ANA檢測的意義有助于疾病的診斷如抗Sm是SLE標記抗體；

抗ScL-70是SD的標記抗體；抗Jo-1是PM/DM的標記抗體；觀察疾病活動度和治療反應研究發(fā)病機理第4頁/共34頁【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗組蛋白（Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）第5頁/共34頁幾種ENA的由來及同義詞Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma第6頁/共34頁【ANA由來】中性粒細胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補體均質體LE細胞LE細胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結締組織病，藥物過敏，慢活肝等亦可陽性?？笵NP取代LE細胞的檢測+第7頁/共34頁ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第二抗體第8頁/共34頁ANA的篩選：間接免疫熒光法第9頁/共34頁實驗原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應；隨后，結合抗體可與標記熒光的二抗進行反應，并可在熒光顯微鏡下觀察。第10頁/共34頁抗原人特異性抗體FITC標記的抗人抗體FITC

FITC載片實驗原理：第11頁/共34頁生物薄片馬賽克TM技術第12頁/共34頁【實驗步驟】第13頁/共34頁實驗步驟一：準備檢查加樣板是否反應區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3％的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時。只有當載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進行標記。第14頁/共34頁實驗步驟二：樣品準備1:100稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻。第15頁/共34頁實驗步驟三：加樣在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽性對照陰性對照第16頁/共34頁實驗步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫（18-25℃）溫育30分鐘。第17頁/共34頁實驗步驟五：沖洗

用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。第18頁/共34頁實驗步驟六：加樣

將20μl熒光標記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個反應區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個載片）。建議使用連續(xù)加樣器。加樣前應使用加樣器混勻。為節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結合物至另一個加樣板的反應區(qū)中。第19頁/共34頁實驗步驟七：孵育

從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質，不要擦拭反應區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。第20頁/共34頁實驗步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。可在每150ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍進行復染。第21頁/共34頁實驗步驟九：封片

在蓋玻片上滴加甘油/PBS。封片體積:10μl/反應區(qū)(5x5mm)從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調整位置，正確放置。然后再進行下一個載片的操作。第22頁/共34頁實驗步驟十：結果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。第23頁/共34頁結果判讀：熒光顯微鏡下觀察

細胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發(fā)熒光為陰性?？乖谐霈F(xiàn)陽性染色細胞為ANA陽性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進一步稀釋后測定效價。第24頁/共34頁【均質型】

細胞核呈均勻一致的熒光

第25頁/共34頁【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光第26頁/共34頁【斑點型】(顆粒型)

細胞核內呈現(xiàn)斑點狀熒光第27頁/共34頁【胞漿型】第28頁/共34頁【著絲點型】第29頁/共34頁

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型第30頁/共34頁ANA結果判斷1：100陰性陰性，標本中未檢測到抗核抗體1：100陽性微量對于核均質性、著絲點、核點型等熒光模式，提示某種風濕性疾病或其他疾病1：320陽性陽性提示某種風濕病或其他疾病滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應的最高稀釋度第31頁/共34頁【臨床意義】總的ANA檢測在臨床診斷與鑒別診斷中是一個極為重要的篩選試驗。絕大多數(shù)自身免疫性疾病均可呈陽性。ANA陽性者進一步檢測各亞類ANA抗體對明確診斷、臨床分型、病情觀察、預后及治療評價有重要意義。未經(jīng)治療的、活動性SLE的陽性率為80%－100%。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混合性結綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等。干燥綜合癥（SS）、類風關、橋本甲狀腺炎等。第32頁/共34頁活動性SLE

（95-100%）非活動性SLE

（80-100%）藥物誘導的紅斑狼瘡 （100%）混合結締組織病 （100%）類風濕關節(jié)炎 （20-40%）其他風濕性疾病