分子生物學(xué)實驗實驗一DNA重組實驗

第一頁，共十四頁。

要求1、實驗室內(nèi)禁止飲食、勿高聲談話、隨意走動。2、課前預(yù)習(xí)、課中認真操作和課后的實驗報告。3、妥善保管好每組的實驗器具。4、實驗操作要求人人動手。5、每次實驗完畢要驗加樣槍的準確性，然后做好值日衛(wèi)生工作。第二頁，共十四頁。第3周DNA重組實驗第4周原核表達蛋白的SDS電泳分析第5周WesternBlottingI第6周WesternBlottingII第三頁，共十四頁。時間分配實驗內(nèi)容10:00-10:30酶切加樣10:30-12:3037℃酶切；原理講述12:30-13:30回收13:30-14:00連接加樣14:00-16:0025℃連接；休息16:0-16:30轉(zhuǎn)化16:30-17:3037℃孵育培養(yǎng)；倒平皿17:30-18:00涂布第四頁，共十四頁。學(xué)習(xí)DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將T載體上所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到表達載體上。一、實驗?zāi)康亩?、實驗原理限制性?nèi)切酶可識別特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)；選擇表達載體pET28a多克隆位點上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現(xiàn)外源片段的克隆。第五頁，共十四頁。實驗材料：

外源片段DNA——CHY基因的PCR產(chǎn)物；載體——pET28a-egfp（含有綠色熒光蛋白DNA片段）；BL21感受態(tài)細胞（鼎國公司）；培養(yǎng)皿；37℃搖床及培養(yǎng)箱。實驗試劑：限制性內(nèi)切酶(EcoRI;XhoI)（TaKaRa公司）；T4DNA連接酶；LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基；卡那霉素（kana）:工作濃度100μg/mL；氯仿/異戊醇（24:1）；無水乙醇；3MNaAc；70%乙醇；ddH2O。三、實驗材料與試劑凝乳酶第六頁，共十四頁。四、實驗步驟1．載體pET28a-egfp和外源DNA片段的限制性酶切：（50μl反應(yīng)體系，用1.5mltube，冰上操作）試劑加樣量DNA5μlEcoRI1μlXhoI1μl10×buffer5μlddH2O38μl37℃反應(yīng)1hr。分別取8μl外源片段酶切產(chǎn)物和5μlpET28a-egfp酶切產(chǎn)物于1.0%凝膠檢測酶切是否完全；按2-5步純化、回收DNA。2．加入ddH2O200μl（擴大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000g離心10min；3．吸取上清200μl，加3MNaAc15μl和無水乙醇400μl，-20℃放置15分鐘以上；4．13000rpm離心10分鐘；5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后外源DNA溶于10μlddH2O（1.5mltube中），pET28a-egfp溶于10μlddH2O（1.5mltube中）；第七頁，共十四頁。6．連接反應(yīng)（15μl體系）：試劑加樣量CHY10μlpET28a-egfp2.5μl10×buffer1.5μlT4Ligase1μl25℃30min7.取1只滅菌的EP離心管，a.每管加入感受態(tài)懸液50ul及連接產(chǎn)物或質(zhì)粒50-100ng15ul（無菌操作）；b.混勻（不可以振蕩），冰浴30min；c.取出放入42C水浴中熱休克90秒，不要搖動試管，迅速放入冰中，冰浴5min。d.向每管中加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基400ul，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)液?；靹蚝?，于37C（100～150rpm）溫和搖振培養(yǎng)60min，使細胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（kanar）。第八頁，共十四頁。8.制備含有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板。9.篩選培養(yǎng)：取轉(zhuǎn)化反應(yīng)液200l，均勻涂布于含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上。將涂布好的平皿置37C平放20min，然后倒置培養(yǎng)12-16h。（期間應(yīng)注意觀察，當(dāng)菌落生長良好，而相鄰菌落尚未相互重疊時，即停止培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)菌落太多或太少時，應(yīng)改變轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的用量，重新涂布培養(yǎng)。）第九頁，共十四頁。1.使用酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10以下，否則，酶活性將受影響。2.吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌，每次吸頭用畢應(yīng)更換，不要互相污染試劑。3.加試劑前，應(yīng)短促離心10秒鐘，然后再打開管蓋，以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。4.防止雜菌和雜DNA的污染。整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等應(yīng)是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。5.離心操作一定要在低溫下進行，所用的水、Eppendorf管都要在冰上預(yù)冷，不能離開冰浴，否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。6.37℃振蕩培養(yǎng)時間不宜過長，否則會出現(xiàn)很多的衛(wèi)星菌落和輕微的菌膜干擾。7.平板涂布重組體時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細胞的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂、死亡，影響轉(zhuǎn)化效率。8.涂布后培養(yǎng)時間不宜超過24h，否則會出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。五、注意事項第十頁，共十四頁。試驗設(shè)定二組，1、宿主菌涂布；2、轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的受體菌涂布。最后比較培養(yǎng)好的平皿，可以看到：①含抗菌素培養(yǎng)皿上的受體對照組并沒有長出菌落，證明受體菌對抗菌素是敏感的，并證明在本實驗中沒有發(fā)生抗藥性突變。②轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的受體菌在含抗菌素的培養(yǎng)皿中也長出了菌落，這不是受體菌的抗藥性的自發(fā)突變株，肯定是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細菌后的轉(zhuǎn)化體，這是因為帶抗藥性的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細菌后，使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性這一遺傳特性的結(jié)果。六、結(jié)果觀察及分析的原則第十一頁，共十四頁。由于此實驗過程涉及多個實驗環(huán)節(jié)，如酶切、連接、感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)化等各方面的效率，因此在實驗中經(jīng)常會出現(xiàn)一些問題。如：1.酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。2.DNA濃度過低時可適當(dāng)濃縮后再酶切，濃度過高可能酶切不完全可以適當(dāng)稀釋酶切。3.反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)，如果底物DNA較多可以延長酶反應(yīng)時間。七、常見問題分析及處理第十二頁，共十四頁。1.限制性酶切反應(yīng)及DNA連接反應(yīng)要注意哪些要點？2.如果一個DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被切動，你認為可能是什么原因？3.轉(zhuǎn)化后，涂布之前為何要在400μLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h？4.如何制備平板？重組體涂布時應(yīng)注意哪些操作？5.影響轉(zhuǎn)化的主要因素有哪些？八、思考題第十三頁，共十四頁。內(nèi)容總結(jié)分子生物學(xué)實驗。實驗一DNA重組實驗。1、實驗室內(nèi)禁止飲食、勿高聲談話、隨意走動。2、課前預(yù)習(xí)、課中認真操作和課后的實驗報告。限制性內(nèi)切酶可識別特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)。外源片段DNA——CHY基因的PCR產(chǎn)物。載體——pET28a-egfp（含有綠色熒