第十一課：流式細胞術(shù)測定植物基因組大小概論第一頁，共25頁。流式細胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)流式細胞術(shù)，即利用流式細胞計對處在快速直線流動狀態(tài)中的單細胞活生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)，是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項技術(shù)，綜合了激光技術(shù)、計算機技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)等各學(xué)科的知識，它是一種自動分析的技術(shù)。流式細胞儀(FlowCytometer)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、流體力學(xué)為一體的一種新型高科技儀器。概念一流式細胞術(shù)的基本知識第二頁，共25頁。流式細胞術(shù)特點單細胞懸液或生物顆粒

分析速度高多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進的細胞定量分析技術(shù)高靈敏度無害分析和分選第三頁，共25頁。FACSCalibur流式細胞分析儀EPICSXL流式細胞分析儀國際兩大流式細胞儀生產(chǎn)商：

BD(BectonDickinson)公司：FACSCalibur、FACSAria、FACSVantageDiva等；

BC(BeckmanCoulter)公司：EPICSXL/-MCL、CytomicsTMFC500系列等。目前流式細胞儀可分為兩類：臺式機和大型機第四頁，共25頁。特點：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定自動化程度高操作簡便使用壽命長配備1-2根激光細胞分選速度慢，主要用于細胞分析臨床型(BD,FACSCalibur臺式機)第五頁，共25頁。大型機(BD,FACSAria科研型)特點：分辨率高選配多種波長和類型激光器可把感興趣細胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析第六頁，共25頁。流式細胞儀檢測范圍細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞內(nèi)細胞因子細胞活性酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞功能第七頁，共25頁。細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/通路分析細胞間相互作用分子共定位與胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運細胞形態(tài)學(xué)熒光原位雜交基因表達分析細胞凋亡細胞周期分析白細胞亞群分析

ImageStream成像流式細胞儀COPASTM生物分選系統(tǒng)流式細胞技術(shù)的最新突破分選微型模式生物COPAS在線蟲分選方面的應(yīng)用，就在Nature系列雜志上發(fā)表了7篇以上的文獻模式動植物研究、大體積細胞研究及藥物篩選等方面第八頁，共25頁。流式細胞儀的工作原理光學(xué)系統(tǒng)

激光光源 光收集系統(tǒng)液流系統(tǒng)

流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)電子系統(tǒng)

光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)第九頁，共25頁。InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱第十頁，共25頁。分選系統(tǒng)488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第十一頁，共25頁。FALSSensor90LSSensorLaser信號檢測--散色光FSC(前角散射光)它反應(yīng)細胞的相對大小和截面積的大小SSC(90度角散射光)代表細胞的顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化它反應(yīng)細胞的物理特性,根據(jù)前側(cè)向散射光，可以把不同類型的細胞群加以區(qū)分第十二頁，共25頁。數(shù)據(jù)顯示類型單參數(shù)直方圖（Histogram）X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率第十三頁，共25頁。二維等高圖和密度圖第十四頁，共25頁。

二維點圖DotPlot便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計不同的細胞群可以用不同的顏色標(biāo)記主要表達方式第十五頁，共25頁。Pseudo3DPlot3DPlot第十六頁，共25頁。利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等)與細胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染色的細胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細胞儀通過測定細胞的熒光強度推算出細胞的DNA含量。二植物C值分析原理流式細胞儀計算測量DNA含量實際上是細胞周期的測量，由于細胞核G1期的DNA含量反應(yīng)一個細胞的倍性，因此常用DNA含量來估計細胞倍性，包括DNA的絕對含量或相對含量。

第十七頁，共25頁。測量DNA的絕對含量時，須設(shè)一個已知DNA含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品作對照，來換算出DNA的絕對含量。

樣品2CDNA含量=[(樣品G0/G1峰均值)/(標(biāo)準(zhǔn)G0/G1峰均值)] ×標(biāo)準(zhǔn)2CDNA含量(pgDNA)測量DNA的相對含量時，須設(shè)一已知倍性的同類材料作照，換算出待測樣品的DNA相對含量，進行倍性分析。0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAcontent2N4Ncount第十八頁，共25頁。變異系數(shù)(CoefficientofVariation,CV)：通常以G0/G1峰的寬度來反映,該指標(biāo)反映了儀器的分辨率或精確度。影響CV的因素主要包括兩方面：儀器因素（如鞘液的流速、光路、機器調(diào)試等）和樣本制備(如樣品中碎片含量、細胞團塊、細胞活性和細胞濃度等)及染色過程對標(biāo)本的人為影響。優(yōu)化DNA分析條件就是指最大程度地減少這兩大因素帶來的變異。DNA指數(shù)(DNAindex,DI)：DI指的是樣本G0/G1峰的平均道數(shù)與正常二倍體G0/G1峰的平均道數(shù)之間的比值。DI為1意味著二倍體(2c)。倍體(Ploidy)：原指染色體數(shù)目，流式中用來描述總的DNA含量。二倍體細胞有正常細胞的DNA含量但不除外染色體異常。DI為1.9-2.1的細胞為四倍體(CV<5%)。除二倍體和四倍體，其他均稱異倍體。DNA檢測的常用術(shù)語DI=樣品G0/1細胞峰均道值正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細胞G0/1期細胞均道值第十九頁，共25頁。DNA的倍體和DNA指數(shù)的關(guān)系DI=1.0±0.01二倍體DI=1.0±0.15近二倍體DI=2.0±0.1四倍體DI>2.10多倍體例：第二十頁，共25頁。G2MG0G1s0

200

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600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontent2N4NNormalCellCycle

count第二十一頁，共25頁。02004006008001000PIFluorescenceDNAAnalysisAneuploidpeakDNAindex1.212N4N第二十二頁，共25頁。Loureiroetal.,2007.Fig3復(fù)葉槭獼猴桃檸檬馬鞭草檸檬柿子無花果第二十三頁，共25頁。

植物組織細胞核懸準(zhǔn)備

熒光染色上機檢測圖像數(shù)據(jù)流式細胞術(shù)測C值主要流程

統(tǒng)計、分析ModFit試管苗、幼葉、愈傷等Galbraith(Galbraithetal.,1983)LB01(Dolezˇeletal.,1989)OttoⅠⅡ(Otto,199