肝受體激動劑抑制炎性體活化 吉林大學動物醫(yī)學學院吉林長吉林大學第一醫(yī)院，吉林長春受體激動劑對配體誘導小鼠巨噬細胞炎性復合體活化的影響，應用熒光定量方法測定肝Ｘ受體激動劑對ＬＰＳ誘導的ＮＬＲＰ３等表達的影響，并用免疫蛋白印跡的方法檢測Ｃ的活化片段。結果證明肝受體激動劑能抑制炎性體的活化。ＬＸＲｓ激動劑的抑制作用，部分源于其抑制ＮＬＲＰ３和ＩＬ１β的轉錄。肝號 文獻標志碼 文章編號ｎＨＵ１１，ＤＵ１Ｉ２，ＨＡＮＷｅｎｙｕ１，ＹＡＮＧ＊，ＣＨＥＮ＊ｆｎｔｉｌｎ ｈｙｎｅｎ３ｍＲＮＡｈＳｆ１ｙｙｆｓ ｎ ｄｎ．ｅ*Ｅｗ天然免疫系統(tǒng)是抵御病原微生物和感受危險信號的第一道防線。病原來源的病原相關分子模式或細胞內外源性的損傷因子損傷相關分子模式被胚系編碼的模式識別受體識別啟動天然免疫反應清除或應激損傷實現(xiàn)宿主防御。主要的模式識別受體包括受體ＡＩＭ２樣受體以及Ｃ型凝集素樣受體等。收稿日期基金項目國家自然科學基金資助項目教育部新８

樣受體在天然免疫系統(tǒng)中的重要作用已經(jīng)成為近年來人們關注的熱點。人ＮＬＲｓ家族蛋白有個成員小鼠有個成員。目前發(fā)現(xiàn)ＬＲｓ的ＡＩＭ２參與構成炎性體ａｏ結構。炎性體是胞漿中的多蛋白大分子復合物，由上述識別受體分別與接頭蛋白ＡＳＣ和ｏｐ組成而不需要可以直接通過ＣＡＲＤ域間相互作用與形成復合物［２］。炎性體裝配后刺激剪切活化為具酶活性的水解ｏＩＬβ促進其剪切成熟并釋放到胞外，從而發(fā)揮廣泛的生物學效應。目前以炎性體研究最為深入已發(fā)現(xiàn)多種病原病原成分或產物結晶物質等可以活化炎性體菌［］尼日利亞菌素［］尿酸鹽晶體膽固醇晶體［９以細胞釋出的ＴＰ［１］氧化的線粒體于炎腫瘤過敏等多種疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用，調控炎性體活化將成為預防和治療這些疾病的重要策略。肝Ｘ受體ｒＸ是核受體超家族中的成員能調節(jié)膽固醇和脂肪酸代謝。ｓ有α和β兩個亞型多種氧化固醇類物質如羥化膽固醇羥化膽固醇等是其天然激動劑和是其合成配體而被廣泛用于ｓ功能研究。近年來的研究表明ｓ不僅參與脂質代謝而且在抗、促進凋亡細胞吞噬清除炎癥等免疫反應調節(jié)中起重要作用ｓ對炎性體信號是否具有調節(jié)作用對該問題的闡明不僅有助于拓展炎性體的調控理論知識并將為深入探討代謝調節(jié)與炎性體信號之間交互機制奠定基礎。１材料與方法 材 購自公司購自ａ公司

ｎｅｒｘ購自公司Ｒ引物由生工公司合成１ＧＨＲａＣｅβＩＳＡ試劑盒購自公司。提取和ＲＴＰＣＲ將小鼠巨噬細胞系和分別分為以下組空白對照組組ＬＰＳ組和組。利用終濃度為Ｌ的培養(yǎng)６ｈ后，再加入ＬＰＳ培養(yǎng)４ｈ。每個樣品重復３次。收集上述各組細胞按試劑說明書提取進行逆轉錄合成ｃＤＮＡ。取逆轉錄產物進退火。反應結束后取ＰＣＲ反應產物１０μ進行瓊脂糖凝膠電泳。同時將逆轉錄產物進行ＲｅｅＰＣＲ，以表達量最高的樣品分別稀釋為ｇ作為標準品ｅ反應過程９５℃３循環(huán)４０次。以目的和內參ＧＡＰＤＨ的比值作為相對ｍＲＮＡ濃度進行分析。相關引物及序列見表１。表１引物序列及產物長度上游引物 下游引物產物長度 細胞培養(yǎng)上清蛋白的提取和分析分為以下組空白對照組ＬＰＳ組ＬＰＳ＋ＡＳ＋ＡＴＰ組。的終濃度為Ｌ培養(yǎng)再加入１Ｌ的培養(yǎng)４，最后加入５Ｌ刺激。每個樣品重復３次。收集上述細胞培養(yǎng)上清取不同處理組的相同體積培養(yǎng)上清加入相同體積的甲醇再加入／４體積的氯仿離心棄上清加入１Ｌ甲醇再次離心棄上清溶解煮沸分離樣品；將蛋白轉至ＰＶＤＦ膜上脫脂奶粉室溫封閉一

１５Ｌ發(fā)光暗室壓片顯影。試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)上清中總ＩＬ１β的含統(tǒng)計學分析所有資料采用統(tǒng)計分析軟件進行處理分析組間比較采用方差分析。Ｐ表示差異顯著Ｐ表示差異極顯著。２ 在小鼠巨噬細胞系上的表達見圖１。用ＬＴ０９０１３１７處理小鼠巨噬細胞７和細胞６ｈ后提取總ＲＮＡ，半定量Ｐ

劑刺激前后表達情況結果７和細胞均表達２種ｓ受體，并且外源激動劑處理后α的表達水平顯著上調而的表達水平?jīng)]有明顯變化。因而７和細胞均可用于ｓ受體信號的研究。水平首先以７細胞為研究對象應用半定量ＰＣＰｒｏ見圖２Ａ。結果表明能誘導β和ＮＬＲＰ３的轉錄并且其誘導作用能被抑制。ｏ１表達于７細胞但未見明顯調節(jié)作用。細胞不表達ＡＳＣ基因并且ＬＰＳ也不能誘導其表達。由于分子在炎性復合物的裝配中起重要作用進而以巨噬細胞系為研究對象分析該細胞是否適宜于炎性

體活化和調節(jié)結果細胞不僅表達ＡＳＣ，而且ｏ１ＮＬＲＰ３的表達及調節(jié)趨勢與７細胞類似。為了確證ＬＰＳ和對和 轉錄的影響應用熒光定量ＰＣＲ進一步分析２種 的表達水平見圖。結果表明，達預處理顯著抑制ＬＰＳ的誘導作用Ｐβ降低了約倍而降低了約倍７ＲＰ３ｍ水平。空白對照組組處理組處理組。＊＊＜０．０１ｓ激動劑抑制炎性體的活化見配體進行后續(xù)研究。ＬＰＳ預處理細胞后外源能明顯誘導細胞培養(yǎng)上清中激動劑刺激細胞ｔ方法檢測表明細胞培養(yǎng)上清中有ｏ１和其剪切成熟片１的表達。結果表明單獨用ＬＰＳ處理并不能誘導１表達聯(lián)合刺激后可以看到１明顯被激活，ＬＸＲｓ明顯抑制的活化效應。為了驗證的作用同時分析ＬＸＲｓ的另一激動劑的作用應用的方法檢測細胞上清中總ＩＬ１β的表達量ＬＸＲｓ激動劑的調節(jié)作用與１類似，ＡＴＰ顯著促進ＩＬ１β的分泌明顯抑制的誘導效應。３適當?shù)难仔泽w激活有利于宿主防御，但是過度的３反應會多種疾病如痛風、慢性關節(jié)炎及多種自身免疫性疾?。郏?。因此ＮＬ炎性體與免疫平衡密切相關如何調控過度激活的炎性復合體成為本試驗關注的重點。ｓ是膽固醇代謝調節(jié)信號越來越多的研究表

明１４］ｓ是否是脂質代謝和炎癥反應交互影響的橋梁分子，等待人們的深入研究證明。本試驗以激動劑對炎性體的影響作為研究切入點為豐富ＮｓＲＰ炎性體之間以及２種信號如何調節(jié)代謝與炎癥平衡等奠定工作基礎。巨噬細胞作為天然免疫反應的重要組成部分，是機體清除病原體的先鋒細胞也是炎癥反應的主要場所。本研究中和細胞被選為研究用巨噬細胞。ＬＸＲｓ激動劑的信號傳遞信賴ＬＸＲｓ受體表達２種小鼠巨噬細胞均表達ＬＸＲαＬ而且可以誘導它們表達升高說明蛋白ＡＳＣ和ｏ酶種巨噬細胞是否適宜用于炎性體調節(jié)研究有待驗證。細胞表達種分子而不表達接頭蛋白ＡＳＣ，因此細胞并不適宜用于ＮＬＲＰ３炎性體研究。ＮＬＲＰ３炎性體可被多種因素激活研究選用較多的是ＬＰＳ＋ＡＴＰ經(jīng)典組合本研究也同樣選擇通過ｔｔ和顯著抑制１的剪切成熟同時抑制了巨噬細胞總ＩＬ１β分泌和產生，并且ＬＸＲｓ的另一激動劑具有相似的抑制ＬＲＰ３炎性體活化通常有２個信號傳遞第個信號是通過影響ＮＦｋ轉錄因子活性促進ＮＬＲＰ３炎性體相關分子的表達另一信號是通過影響Ｋ＋離子外流誘導寡聚形成大分子平臺［１５］。本研究結果證明ｓ外源激動劑可以顯著抑制ＬＰＳ誘導的β的綜上所述本試驗結果表明活化的ＬＸＲｓ對ＮＬＲＰ３炎性復合體有顯著的抑制作用這為探討肝Ｘ受體調控炎癥反應的相關機制提供新的思路也可能為研制抗炎藥物提供新的靶標。參考文獻ｏｙｃｓｆ